فبراير 13, 2011
نحن تصف وضع بروتوكول لمراقبة وتحليل الخلية المسارات المتداول على ركائز مستقبلات نقوش غير المتماثلة. البيانات الناتجة هي مفيدة للهندسة من مستقبلات منقوشة ركائز للتسمية خالية من فصل الخلية وتحليلها.
يراقب هذا البروتوكول ويحلل مسارات تدحرج الخلايا على أنماط مستقبلات غير متماثلة لتسهيل هندسة ركائز أنماط المستقبلات لفصل الخلايا وتحليلها دون استخدام واسمات؛ يبدأ ذلك بطباعة الملامسة الدقيقة لجزيئات PEG على ركيزة ذهبية لإنشاء أنماط متبادلة من الطبقات أحادية الجزيئات ذاتية التجميع، يلي ذلك ملء الفراغات في الركيزة بمستقبلات P select. بعد ذلك، يتم دمج الركيزة مع غرفة التدفق. ثم يتم تدفيق خلايا HL 60 إلى داخل الغرفة.
قم بتسجيل تسلسل صوري للتفاعل التدحرجي لخلايا HL 60 على أنماط P selectin، ثم قم بتحليل الصور التي تم تحويلها من الفيديو. يمكن الحصول على مسارات تتبع حواف الخلايا المتدحرجة، وطول التدحرج، وسرعات التدحرج على المستوي والمنطقة والحافة باستخدام برنامج MATLAB. يمكن أن توفر هذه الطريقة رؤية تحليلية حول كيفية تحرك خلايا HL 60 على أنماط المستقبلات غير المتماثلة في تدفق القص.
يمكن تطبيق ذلك لتقدير التفاعلات السطحية للخلايا الأخرى كمياً، والتحليل المباشر للخلايا من خلال مراقبة مساراتها على أنماط المستقبلات. وكذلك لتصميم أجهزة التثبيت الدقيقة لفصل الخلايا. تُستخدم تقنية الطباعة بالتلامس الدقيق لإنشاء أنماط متبادلة من الطبقات الأحادية ذاتية التجميع لجزيئات peg على ركيزة الذهب.
أولاً، قم بتحبير ختم PDMS باستخدام محلول PEG بتركيز 5 millimolar في الإيثانول. جفف السطح لمدة 20 دقيقة. ضع الختم برفق على سطح الذهب لمدة 40 ثانية، وتأكد من وجود تلامس جيد بين سطح الذهب والختم.
لا يتطلب الأمر ضغطاً إضافياً. اشطف السطح باستخدام الإيثانول وجففه تحت تيار من النيتروجين. الآن، وباستخدام غرفة تروية، قم بحضن الركائز مع محلول P selectin بتركيز 15 micrograms per milliliter لمدة ثلاث ساعات في درجة حرارة الغرفة لنمط المناطق المتبقية بـ P selectin، ثم اشطف الغرفة، وبعد ذلك قم بملء السطح بـ BSA بتركيز one milligram per milliliter لمدة ساعة واحدة لمنع التفاعلات غير النوعية.
اغسل السطح باستخدام محلول DPBS المنظم قبل إجراء تجربة تدحرج الخلايا. قم بتجميع غرفة التدفق، ثم مرر معلقاً من خلايا HL 60 بتركيز 10⁵ خلية لكل ملليلتر فوق الأسطح ذات الأنماط في غرفة تدفق مستطيلة بزوايا ميل لنمط المستقبل تبلغ 10 درجات.
عند درجة حرارة غرفة تبلغ 24.5 °C. اضبط مضخة السرنجة لتوليد معدل تدفق قدره 75 µL/min مع إجهاد قص صفحى مقابل يبلغ 0.5 dyn/cm². الآن، وباستخدام مجهر مقلوب وكاميرا مثبتة، قم بتسجيل تدحرج خلايا HL 60.
التفاعلات مع الجزيئات الملتصقة p-selectin والركائز. باستخدام عدسة شيئية بقوة تكبير 4x وبمعدل إطار واحد في الثانية ولمدد زمنية تصل إلى 300 ثانية. يتم إجراء ثلاث تجارب مستقلة.
اعرض البيانات في صورة المتوسط والانحراف المعياري للقيم المتوسطة التي تم الحصول عليها من كل تجربة. صور مجهرية تم تحويلها من فيديو HL 60.Rolling. تُظهر التفاعلات مع p select اللاصق والركائز مناطق مضيئة ومظلمة تقابل مستقبل p selectin ومناطق PEG على التوالي.
يتم تحديد المسارات هنا باستخدام برنامج MATLAB مخصص. كانت زاوية ميل الحافة 10 درجات وإجهاد القص 0.5 dines لكل سنتيمتر مربع. أُجريت تحليلات إضافية حول توزيع طول تتبع الحافة، والقيمة المتوسطة لطول تتبع الحافة، بالإضافة إلى VE وVP، وهما سرعات التدحرج على حافة النطاقات وداخلها.
بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية فحص مسارات الخلايا في أنماط المستقبلات غير المتماثلة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
يرصد هذا البروتوكول ويحلل مسارات تدحرج الخلايا على أنماط مستقبلات غير متماثلة لتسهيل هندسة ركائز أنماط المستقبلات من أجل فصل الخلايا وتحليلها دون استخدام واسمات.
إن فهم مسارات تدحرج الخلايا على أنماط مستقبلات غير متماثلة يتيح التصميم العقلاني لأجهزة الفصل الموائع دقيقة الخالية من الوسوم. يوفر هذا البروتوكول بيانات كمية حول طول تتبع الحواف وسرعة التدحرج تحت إجهاد قص محدد، مما يدعم النمذجة التنبؤية لسلوك الخلايا في التدفق. وتساهم هذه الرؤى في تقليل التكرار التجريبي في هندسة الأجهزة المستخدمة في سير عمل تنقية الخلايا والتحليل المظهري.
تندرج هذه الطريقة ضمن مراحل الاكتشاف المبكرة لتوجيه تطوير المقايسات وإنشاء الأدوات قبل السريرية، ولا سيما بالنسبة للأهداف التي يكون فيها الالتصاق تحت التدفق بمثابة قراءة وظيفية.