رسم الخرائط وتطبيق التعبير Flippase محسن شرك في اليرقات والكبار ذبابة الفاكهة CNS

الهدف العام من التجربة التالية هو تحسين تعبير GAL الرابع من خلال استخدام الليباز الخاص بالأنسجة باستخدام أدوات تحويل GAL 80. يتم تحقيق ذلك من خلال إنشاء مجموعة من خطوط الذبابة المعدلة وراثيا في فخ محسن فيليب وتحديد نمط تعبير الجهاز العصبي المركزي للليباز في كل سطر. باستخدام مراسل GFP ، يمكن لتقارير الكيمياء المناعية و GFP التمييز بين GL والتعبير العصبي لتقاطع تعبير GAL الأربعة في خطوط الاهتمام ET ، وخطوط الوجه عبر الذباب الذي يحتوي على أداة تحويل GAL 80 في النسل.

يمكن استخدام التحليل النسيلي لتحليل صقل تعبير GAL الأربعة ، كما هو الحال في العين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الأساليب الحالية هي أنه يمكن استخدام الخطوط القائمة على اللعب على مسار المحسن جنبا إلى جنب مع أدوات تحويل GAL 80 مع مجموعة سريعة من تحالف GAL four المتاح بالفعل في مجتمع الطيران. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن توسيع هذا المفهوم ليشمل الكائنات النموذجية الناشئة الأخرى من GALI الأربعة بدون طيار مثل أسماك الزرد.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في رسم خرائط الدوائر العصبية الكامنة وراء السلوك. على الرغم من أن هذا البروتوكول يوضح استخدام قاعدة الوجه في مجموعة فرعية من الخلايا المستقبلة للضوء ، إلا أنه يمكن تطبيق الطريقة المتقاطعة لتحليل الأنسجة الأخرى ، بما في ذلك الأنسجة غير العصبية. كما يتم تمييز خطوط الليباز فخ المحسن.

النقرس أربعة الولايات المتحدة هي تقنية مهمة يستخدمها علماء الأحياء على نطاق واسع. أحد التحذيرات لمعظم أسطر GAL الأربعة هو ذلك الذي يتم التعبير عنه على نطاق واسع جدا بحيث لا يمكن استخدامه لرسم خرائط سلوك الدماغ باستخدام طرق الإصبع. لا يمكن ضبط تعبير GAL الأربعة في القمصان ذات الأهمية قبل استخدام الجين المعدل وراثيا ET لتقييد التعبير جزئيا عن خطوط التعبير الأربعة ل GAL.

من المفيد أولا معرفة نمط التعبير عن ET flip x اثنين من الجينات المعدلة وراثيا في المرحلة المتأخرة من تطوير الحمم البركانية وفي البالغين لتصور تعبير الوجه في الجهاز العصبي المركزي ، قم بإعداد تقاطع بين الذكور مع ET t flip X اثنين من الجينات المعدلة ذات الأهمية والإناث البكر التي تؤوي مراسل GFP للتعبير عن الوجه et من النسل. اجمع يرقات F1 المتجولة في الطور الثالث للتشريح. ضعها في طبق واقي S نظيف وقم بإزالة أي حطام بفرشاة الرسم واشطف الطبق مرة واحدة باستخدام PBS مرة واحدة.

الآن املأ الطبق بالثلج البارد مرة واحدة PBS لتخدير اليرقات للوصول إلى الجهاز العصبي المركزي للحمم البركانية ، وعقد خطاف فمها بزوج من الملقط. أمسك بشرة بالقرب من الكروية الأمامية الممتدة وقشرها مرة أخرى. يظل الجهاز العصبي المركزي متصلا بخطاف الفم جنبا إلى جنب مع بعض الهياكل الأخرى.

الآن باستخدام الملقط ، قم بإزالة كل تلك الهياكل الزائدة المحيطة بالجهاز العصبي المركزي أثناء تشريح الجهاز العصبي المركزي. انقلها بشكل فردي إلى طبق بيركس بثلاثة عوالم مليء ب PBS. بمجرد تشريح كل الجهاز العصبي المركزي ، قم بإصلاحه عن طريق غمرها بالكامل في 200 ميكرولتر من 4٪ PFA على الجليد.

إذا طفو الجهاز العصبي المركزي ، فلن يتم تنظيفه بالكامل من جميع الأنسجة المحيطة. في حالة حدوث ذلك ، استخدم زوجا من الملقط لإعادة غمر الجهاز العصبي المركزي في المثبت بعد التثبيت لمدة 15 دقيقة ، واغسل المنديل بالثلج البارد PB S3 مرات ثم اغسل الأنسجة ثلاث مرات أخرى في PBT المثلج. الأنسجة جاهزة الآن للتصوير أو وضع العلامات عليها بواسطة الأجسام المضادة أو تخزينها في PBT عند أربع درجات مئوية لوقت لاحق.

تلطيخ من نفس الصليب يستخدم لجعل اليرقات تجمع F1 البالغين قبل التشريح. غمر خمسة إلى 10 ذباب ومبرد 95٪ من الإيثانول لمدة 30 ثانية لإزالة الشمع على سطح البشرة. لإزالة الإيثانول ، اغسل البالغين ثلاث مرات بالثلج البارد مرة واحدة PBS وبعد الغسيل الثالث ، انقل أحدهم إلى طبق واقي سيل 35 ملم مليء بالثلج البارد مرة واحدة PBS لإعداد شخص بالغ للتشريح.

ضعه على الجانب البطني لأعلى وأدخل دبوس العميل في منتصف البطن. ابدأ التشريح باستخدام ملقط لإزالة الساقين. ثم قم بإزالة بشرة الرأس عن طريق تثبيت الرأس عند الدعائم وتقشير البشرة في نفس الوقت من أسفل العين باتجاه أعلى الرأس.

باستخدام ملقط حاد بعناية ، قم بإزالة وتتبع الأنسجة المحيطة بالدماغ لأن تتبع أنسجتك لها تألق ذاتي قوي ويجعل الدماغ يطفو أثناء التثبيت. الدماغ ليس سوى جزء من الجهاز العصبي المركزي للبالغين. الجزء الآخر هو الحبل العصبي البطني أو VNC في الصدر ويجب أيضا تشريحه.

أولا ، قم بإزالة بشرة الصدر عن طريق تثبيت الذبابة في قاعدة الساق الخلفية وسحب بشرة الصدر برفق حتى قاعدة الرقبة. ثانيا ، لفضح VNC ، انشر بلطف نصفي بشرة الصدر. ثالثا ، قم بإزالة البطن من الصدر عن طريق تثبيته في قاعدة الساق الثانية وسحب البطن بعيدا عن قرب ليلة تحريك البطن الأولى.

رابعا ، قم بتنظيف VNC عن طريق تثبيته في منطقة العضد وتمزيق الأنسجة المحيطة ب VNC برفق. قم بتمزيق حلقة النسيج الضام المحيطة بالضام العنقي واستمر في إزالة الأنسجة الزائدة أثناء جمع الدماغ. وتقوم VNC بنقلها على شكل كمثرى إلى طبق بيركس من تسعة عالمات مليء بالمبرد مرة واحدة PBS المحفوظ على الجليد.

لإصلاح الأنسجة البالغة ، اغمرها في 4٪ PFA على الجليد لمدة 15 دقيقة. اتبع الحمام بثلاث غسلات PBS مثلجة وثلاث غسالات PBT. الأنسجة جاهزة الآن للتصوير أو التسمية بواسطة الأجسام المضادة لتحليل التعبير الجيني المعدل بدقة.

من المفيد تسمية الجهاز العصبي المركزي بعلامات عصبية أو دبقية لتوفير إطار مرجعي يبدأ باحتضان الأنسجة عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها مع الأجسام المضادة للخلايا العصبية أو الخلايا الدبقية في اليوم التالي. اغسل المستحضر خمس مرات باستخدام PBT واحتضنه بالجسم المضاد الثانوي الفلوري في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. لف اللوحة والرقائق لمنع التبييض الضوئي للجسم المضاد عند انتهاء الحضانة.

اغسل المستحضر باستخدام PBS وقم بتركيب المستحضر بالكامل على شريحة. استخدم حلقة بلاستيكية من OSHA لمنع سحق الأنسجة بواسطة زلة الغطاء. الجهاز العصبي جاهز الآن لفحصه بحثا عن أنماط تعبير GFP و LL تحت المجهر الفلوري.

عادة ما يتم فحص ثلاث إلى خمس نسخ مكررة لتحديد قابلية تكرار نمط التعبير الوجه. نمط التعبير عن الوجه في الوجه ، يمكن استخدام خط جنبا إلى جنب مع الجينات المعدلة وراثيا الأخرى لتغيير كيفية التعبير عن المثبط الرباعي GAL 80. يعد تغيير تعبير مثبط GAL 80 طريقة فعالة لإجراء التغييرات.

في تعبير GAL الرابع ، تتمثل إحدى الطرق في قلب تعبير GAL 80 باستخدام تعبير GAL 80 المعدل للجينات التي تعطل GAL أربعة ، مما يؤدي إلى تنكس العين في جميع أنحاء العين. يتم استخدام تجزئة خط الوجه ET 6 88 A هنا لتقييم فعالية أداة تحويل GAL 80 في مجموعة فرعية من المستقبلات الضوئية في ذرية F1 ، ومقارنة النمط الظاهري للعين بالنمط الظاهري للعين للسلالات الأبوية. يؤكد أي مظهر لتشوه العين أو تصبغه أن نمط التعبير عن الوجه موجود في المستقبلات الضوئية وأن GAL 80 كان ناجحا.

تتمثل الإستراتيجية المجانية غير الزائدة عن الحاجة في قلب تعبير GAL 80 باستخدام نفس خط الوجه الفائق. هذه الإستراتيجية تشبه إلى حد بعيد الأخرى ، ولكن الآن يتم قمع تصبغ الهوية والتنكس في ذرية F1. في الوجه X اثنين.

التعبير عن المستقبلات الضوئية بمجرد إتقان تشريح الجهاز العصبي المركزي يمكن إجراؤه في حوالي خمس دقائق للبالغين ودقيقة واحدة لليرقات إذا تم إجراؤه بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم استخدام ملقط حاد لإزالة القصبة الهوائية والأنسجة المحيطة بكل من البالغين و Libre C ومن المهم Ss.It استخدام طبق مجاني مثبت للتشريح. يستخدم قلب الصدمة الحرارية حاليا لتوليد نسخ عشوائية.

في المقابل ، يسمح قلب مصيدة المحسن للمرء بإنشاء نسخ قابلة للتكرار ، مما يجعل التحليل المورفولوجي والسلوكي أسهل. قوة أخرى لطريقة الإصبع هي أنه يمكن للمرء أن يقيد أنماط التعبير الأربعة ل GAL باستخدام خطوط إضافية قائمة على قلب مصيدة anan وخطوط gal الأخرى. تتمثل نقطة الضعف في تكوين GAL 80 لإيقاف التوبولين في أن مجموعات معينة من مؤثرات GA four و UAS مثل LAG four و U-A-S-K-I-R غير متوافقة لأنها ستقتل الذباب.

يمكن التغلب على هذه المشكلة بسهولة باستخدام مستجيب UAS مشروط ، مثل UAS Shiri Ts ، والذي يسمح بفحص السلوك في درجات حرارة مقيدة كما هو متوقع. لن تعبر جميع خطوط الليباز المصيدة المحسنة عن مستويات عالية بما يكفي من الليباز لتكون مفيدة. ومع ذلك ، فإن تقنية الإصبع الموضحة هنا توفر نهجا جديدا لباحثي ذبابة الفاكهة لتحسين تحليل الفسيفساء إما لدوائر التطوير أو السلوك.