الفسيولوجية والمورفولوجية وتوصيف الكيميائية العصبية من الخلايا العصبية عن طريق التضمين الحركة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تسجيل الاستجابة الفسيولوجية للعصبونات المفردة أثناء الحركة، ومزيد من التوصيف للمورفولوجيا والكيمياء العصبية لهذه العصبونات. يتم تحقيق ذلك من خلال تخدير الحيوان وتحضيره جراحياً أولاً، تليها خطوة التسجيل الفيزيولوجي الكهربائي للاستجابة داخل الخلوية للعصبونات المفردة أثناء الحركة.

بعد تروية الحيوان ومعالجة الدماغ، تتمثل الخطوة النهائية في تصور وتحليل الاستجابة الفسيولوجية ومورفولوجيا الخلايا العصبية. وفي النهاية، تجمع تقنيات التسجيل العصبي داخل الخلايا والكيمياء المناعية والتحليل لإظهار التعديلات في جهد الغشاء للخلايا العصبية المنفردة أثناء الحركة. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل زراعة الخلايا في الحفاظ على الاتصالات العصبية والمدخلات التشابكية، وعدم فصل الخلايا العصبية ذاتياً أو وضعها في أوساط اصطناعية. وفي اليوم السابق للتجربة، يتم حقن مقتفي عصبي، مثل horse radish peroxidase، في المناطق الطرفية المستهدفة لوسم الخلايا العصبية الحركية تراجعيًا.

في اليوم التالي، يتم تخدير الجرذ ووضعه على وسادة تدفئة، ثم تُحلق البشرة التي تغطي الجزء الخلفي من الجمجمة باستخدام مقصات حلاقة الحيوانات مع اتباع تقنية التعقيم. يتم إجراء شق جراحي على طول الفخذ الداخلي، وإدخال كانيولا في الوريد الفخذي لإعطاء جرعات إضافية من التخدير. كما يتم إدخال كانيولا أخرى في الشريان الفخذي لمراقبة ضغط الدم.

أخيراً، أدخل كانيولا في الرغامي. بعد ذلك، ضع الجرذ في إطار تجسيمي. قم بإجراء عملية فتح جمجمة للكشف عن المخيخ، مع الحرص على تجنب الجيب الوريدي الكبير الموجود مباشرة تحت الوصلة بين العظم الجداري والعظم بين الجداريين.

بعد ذلك، غطِّ سطح الدماغ بزيت معدني دافئ. ثم قم بلصق الفك السفلي بقضيب متصل بهزاز كهرومغناطيسي. يتم التحكم في حركة الفك السفلي عن طريق إشارات تحكم تُرسل إلى الهزاز من مولد إشارات.

ضع بعد ذلك قطب تأريض تحت الجلد بجوار فتحة القحف. وللتحضير للأقطاب الكهربائية داخل الخلوية، املأ الأقطاب الكهربائية الدقيقة بمحلول صبغة IDE أو tetraethyl rod Domine. تتراوح مقاومة هذه الأقطاب من 60 إلى 80 mega ohms للمحاور العصبية كبيرة القطر، ومن 80 إلى 150 mega ohms للمحاور الواردة الصغيرة والعصبونات البينية.

بعد ذلك، ضع القطب الكهربائي الدقيق (micro electrode) في مرحلة الرأس الخاصة بمقياس الكهرومتر باستخدام تلسكوب صغير مثبت في موقعه خلف رأس الحيوان. قم بمعاينة القطب الكهربائي الدقيق عبر عدسة التلسكوب الحمراء المدمجة بقوة تكبير 20x. تقع المنطقة المستهدفة على بعد حوالي 0.5 millimeters من الحدود السفلية للأكيمة السفلية (inferior colliculus).

قم الآن بعمل فتحة صغيرة في الأم الجافية للسماح بتحديد موقع سطح الدماغ بدقة. قم بزيادة تعويض تغذية السعة المرتدة بحيث يتم إنتاج إشارة تغذية مرتدة عند ملامسة القطب للدماغ. قم بدفع القطب إلى الأمام حتى يدخل في الدماغ.

الخطوة التالية هي تفعيل الإزاحة المتكررة للفك السفلي. ثم، وباستخدام محرك خطوي، قم بدفع القطب الكهربائي داخل الدماغ. وعندما يشير اختراق عصبوني إلى انخفاض مفاجئ في جهد dc ونشاط مشبكي مستمر، توقف عن دفع القطب الكهربائي.

عندما يُعتبر الاختراق مستقراً، ابدأ حركات الفك من نوع التدرج والتثبيت (ramp and hold) والحركات الجيبية (sinusoidal). سجل الاستجابة العصبية وقم بتصنيف العصبون بناءً على استجابته. بعد ذلك، ولرسم خريطة للمجال الاستقبالي للعصبون، استخدم مسباراً غير حاد لاستكشاف الجلد حول الرأس والتجويف داخل الفم.

استكشف استجابة العصبون لمحفزات أخرى مثل انقباض العضلات أو المحفزات الضارة. عند اكتمال التسجيلات، احقن تيارًا مستمرًا (DC) يتراوح بين 1 إلى 4 nano amp، بحيث يكون إجمالي الحقن من 15 إلى 70 nano amp minutes. راقب اختراق القطب الكهربائي ثم أوقف حقن التيار.

إذا أصبح جهد الغشاء أكثر إيجابية من 30- ملي فولت، فإن الخطوة التالية هي تقطيع نسيج الدماغ. بعد القتل الرحيم للحيوان وإجراء التروية، قم بإزالة الدماغ. ثم قم بقص مقاطع يتراوح سمكها بين 50 إلى 100 ميكرون في المستوى الجبهي أو السهمي أو الأفقي.

لتصوير العلاقة بين العصبون الحسي المسمى ومجموعة متنوعة من العصبونات الحركية، يتم معالجة النسيج باستخدام H-R-P-D-A-B أو Texas red، وذلك حسب نوع النسيج، كما يمكن إجراء تحليلات إضافية باستخدام مجهر فلوري أو مجهر كونفوكال أو باستخدام برنامج كمي لتحليل التوضع المشترك. ويمكن، حسب الرغبة، إجراء معالجة كيميائية مناعية لبروتين synaptophysin لتحديد مواقع التشابكات العصبية بدقة داخل العصبونات المسمى. يوضح هذا الشكل عصبوناً في جذع الدماغ تم حقنه بـ IDE بعد التوصيف الفيزيولوجي الكهربائي.

بناءً على الاستجابة العصبونية أثناء الحركة، يمكن تحديد هذه العصبونة على أنها عصبونة واردة ثانوية للمغازل العضلية. يشير الإطار البني إلى موقع نواة العصب ثلاثي التوائم الحركية. يوضح هذا الشكل الاستجابة الفسيولوجية لعصبونة حسية أثناء إزاحة الفك.

يتم تمثيل استجابة العصبون كتردد إطلاق فوري. لاحظ أن الاستجابة تحاكي بدقة إزاحة الفك السفلي، مما يشير إلى أن هذا العصبون المحدد يوفر تغذية راجعة حسية مرتبطة بوضعية الفك السفلي. يوضح هذا الشكل عصبوناً حسياً استجاب أثناء سبر العضلات.

صُبغت العصبونة بـ ide بعد المعالجة المناعية الكيميائية. تظهر العصي التشابكية على شكل تورمات حمراء متمركزة في نفس الموقع مع synaptophysin الأصفر. أما اللون الأخضر فهو صبغة فلورية.

يمثل هذا الشكل رسماً متحركاً لمحور عصبي من عصبون وارد أولي للمغزل العضلي. وقد استُخدمت مقاطع بصرية متعددة للعصبون المسمى لإنشاء هذا الرسوم المتحركة. وبناءً على هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل المجهر الإلكتروني، والمجهر البؤري، والوسم العصبي الأمامي أو التراجعي للإجابة على أسئلة إضافية حول الخصائص التركيبية الدقيقة للعصبون، والتوطين المشترك للنواقل العصبية مع النهايات التشابكية، والاتصال العصبي.