الكروماتوجراف الدهون تقارب الحويصلة بوساطة الفرز المغناطيسي باستخدام خلية المنشط (LIMACS) : طريقة جديدة لتحليل البروتين الدهني التفاعل

صُممت هذه التجربة لتحديد البروتينات الرابطة للليبيدات وتحليل التفاعل بين الليبيد والبروتين في بيئة غشائية محددة من الليبيدات. يتم تحضين بروتينات تجانس الخلايا مع حويصلات ليبيدية تم تحضيرها حديثاً من الفوسفاتيديل سيرين والسيراميد. ثم يتم تزويد خليط التفاعل بخرزات مغناطيسية مقترنة بـ Xin V لتثبيت البروتينات المرتبطة بالحويصلات الليبيدية على الخرزات المغناطيسية. بعد ذلك، يتم تنقية الحويصلات الليبيدية البروتينية عن طريق الفرز الخلوي المنشط مغناطيسياً.

لتحديد نتائج البروتين المرتبط بالليبيد الموضحة، استخدم تقنية SDS page Western blotting لإظهار تنقية lyx لبروتين atypical PKC الداخلي والمؤتلف ونطاق ارتباط سيراميد محدد تم التعبير عنه في خلايا MDCK. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية المبتكرة مقارنة بالطرق الحالية مثل Eliza أو مطيافية رنين البلازما مثل الارتباط السطحي، في أن التفاعل بين الليبيد والبروتين يتم تحقيقه في بيئة شبيهة بالغشاء، كما يمكن تنقية البروتينات المرتبطة وتحليلها. وتمتد آثار هذه التقنية نحو علاج وتشخيص الأمراض التي تشمل الليبيدات، لأن التفاعل الفسيولوجي بين الليبيد والبروتين يكون مختلاً في هذه الأمراض.

بالنسبة لبعض هذه الأمراض، فإن البروتينات المستهدفة غير معروفة حتى الآن وتحتاج إلى تحديد. لتصميم علاج قائم على الدهون، ابدأ بتحضير الحويصلات الدهنية الكبيرة (sles) من خليط مجفف من كميات متساوية المولات من phosphatidyl seine و C 16 ceramide في 100 µL من محلول sical المنظم. قم بإجراء المعالجة بالموجات فوق الصوتية (sonication) لمدة ساعة واحدة بعد إضافة 300 µL من محلول iCal المنظم، المدعم بـ 0.1 mM من كلوريد المنجنيز، ثم قم بطرد العينات مركزياً بسرعة 12,000 ×g لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C، وبعد ذلك أعد تعليق كتلة الحويصلات الدهنية الكبيرة في 100 µL من محلول sical المنظم. أضف 1 nM من صبغة vibrant cm DII الفلورية واحضن الخليط عند درجة حرارة 37 °C لمدة ساعة واحدة لتسهيل رؤية جزء الـ SLE بعد الفصل بالـ max؛ استخلص كتلة وردية من phosphate, a Syrian ceramide sles المصبوغة بـ vibrant cm dai عن طريق الطرد المركزي، وأعد تعليقها في 100 µL من محلول tris المنظم.

بعد ذلك، ولتحضير مستخلص خلوي خالٍ من المنظفات، قم بإجراء سونيكة للخلايا في 300 µL من محلول منظم مفرط التوتر يتكون من 10 mM من tris، hydrogen chloride ويحتوي على مثبطات البروتياز والفوسفاتاز، ثم قم بالطرد المركزي. ولإزالة الحطام الغشائي، أضف الآن المستخلص الخلوي الرائق إلى المعلق الفيزيائي للدهون واترك الخليط لمدة ساعتين عند 4 °C. ونظرًا لأن المستخلصات الخلوية قد تحتوي على أغشية داخلية بها phosphate aerin، يُوصى بتنقية المستخلص من هذه الأغشية عن طريق خطوات طرد مركزي إضافية.

أضف إلى خليط التفاعل 20 µL من منظم ربط XNV و50 µL من محلول يحتوي على حبيبات مغناطيسية مقترنة بـ XNV، ثم حضّن الخليط لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 4 °C، وأجرِ عملية فرز الخلايا المنشطة مغناطيسياً وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة. بعد ذلك، راقب فلورة vibrant CM DII في كسور السوائل المارة والكسور الشطفة باستخدام قارئ فلورة الصفائح الدقيقة لتحديد وجود وكمية الليبيدات في مقايسة تنافس الأجسام المضادة. وللتحقق من خصوصية تفاعل ربط A PKC مع حويصلات ceramide phospho Seine، حضّن 1 µg من الجسم المضاد متعدد النسائل للأرنب anti P KC Zeta مع مستخلص خلوي لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 4 °C، يليه التحضين مع الحويصلات الليبيدية.

استكمل تحليل SDS page واللطخة المناعية (immuno blotting) للبروتين المرتبط بـ ceramide phosphate serin sles في المستخلص الأقصى لإعادة التكوين المختبري لمعقد قطبية البروتين الدهني؛ ابدأ بتحضير راسب وردي من vesicles ceramide phosphate serian المصبوغة بـ vibrant cm DII كما هو موضح سابقاً، ثم أعد تعليق الحويصلات في 100 µL من tri buffer، مضافاً إليه 100 µM من gamma S GT P و 1 mM من GDP، ومجموعة من البروتينات المؤشبة (recombinant proteins) محل الاهتمام. بعد ذلك، حضن التفاعل عند درجة حرارة 4 °C لمدة ثلاث ساعات. ثم أضف 5 µL من محلول مخزون بتركيز 20x من X in V buffer و 50 µL من X in V conjugated magnetic beads.

قم بتحضين الخليط تحت تحريك خفيف لمدة 30 دقيقة أخرى عند درجة حرارة 4 °C. استمر في إجراء عملية فرز الخلايا المنشطة مغناطيسياً NX NV وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة لتسهيل عملية الترسيب. أضف مكملاً من 10 µg من albumin النقي إلى جزء الاستخلاص.

ركّز البروتينات عن طريق الترسيب باستخدام طريقة ويل فلو. تتكون الطبقة السفلية من الكلوروفورم والميثانول مع cm dii المركز. تحتوي الطبقة البينية البنية على الحبيبات المغناطيسية والبروتين المترسب.

قم بقياس كمية حويصلات الدهون عن طريق الكشف عن صبغة cm dii الوردية والنابضة في طور الكلوروفورم والميثانول العضوي لتفاعل weyl flu. استخدم كميات متساوية من حويصلات الدهون لتوحيد كميات البروتين بين العينات، ثم قم بالتحليل بواسطة SDS page واللطخة المناعية.

محلل خلوي خالي من المنظفات لخلايا MDCK التي تعبر عن البروتين PKC Zetta كامل الطول والمرتبط طرفياً ببروتين فلوري أخضر أو نطاق ربط السيراميد. تم تحضين الطرف الكربوكسيلي لـ PKC Zetta مع الفوسفوسيرين.

بعد شطف حويصلات السيراميد من عمود Max، تم تحليل البروتينات بواسطة لطخة مناعية. وقد استُعيدت قطعة ارتباط السيراميد C 20 Zeta، وEGFP، والبروتين الكامل P KC Zeta من الجزء الشطفي (eluate) لعمود Max، وهو ما يتوافق مع خصوصية وفعالية إجراء lyx. أما EGFP، وهو التحكم السلبي الذي لم يرتبط بحويصلات السيراميد السورية لدينا، فلم يكن قابلاً للكشف في الجزء الشطفي.

عندما يتم تعزيز تقنية Linx بطرق أخرى مثل SDS page واللطخة الغربية (western blotting) أو تحليل البروتينات (proteomics analysis)، يمكن الإجابة على أسئلة إضافية مثل تحديد البروتينات الموجودة في معقد البروتين الرابط للدهون. وبعد تطويرها، مهدت LabX الطريق للباحثين في مجال أبحاث الدهون المفردة لاستكشاف الموت الخلوي المبرمج الناجم عن السيراميد والاستقطاب الخلوي في الخلايا العصبية الجذعية والخلايا الظهارية.