الكروماتوجراف الدهون تقارب الحويصلة بوساطة الفرز المغناطيسي باستخدام خلية المنشط (LIMACS) : طريقة جديدة لتحليل البروتين الدهني التفاعل

تم تصميم هذه التجربة لتحديد بروتينات ربط الدهون وتحليل تفاعل البروتين الدهني في بيئة غشائية محددة من سلاسل الدهون ، يتم تحضين بروتينات الخلايا المتجانسة مع الحويصلات الدهنية المحضرة حديثا من الفوسفات والسين والسيراميد. ثم يتم استكمال خليط التفاعل بخرز مغناطيسي مترافق Xin V لتثبيت البروتين المرتبط بالحويصلات الدهنية على الخرز المغناطيسي. بعد ذلك يتم تنقية حويصلات الدهون البروتينية عن طريق فرز الخلايا المنشطة المغناطيسية.

لتحديد النتائج التي أظهرها البروتين المرتبط بالدهون ، استخدم صفحة SDS Western Blotting لإظهار تنقية الليكس ل PKC غير النمطية الذاتية والمؤتلفة ومجال ربط السيراميد المحدد المعبر عنه في خلايا MDCK. الميزة الرئيسية لهذه التقنية الجديدة على الطرق الحالية مثل التحليل الطيفي بالرنين الغليزا أو البلازما مثل الربط السطحي ، هي أن تفاعل البروتين الدهني يتحقق في بيئة شبيهة بالغشاء وأنه يمكن تنقية البروتينات المرتبطة وتحليلها. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج وتشخيص الأمراض التي تنطوي على الدهون لأنه في هذه الأمراض ، يضعف تفاعل البروتين الدهني الفسيولوجي.

بالنسبة لبعض هذه الأمراض ، فإن أهداف البروتين غير معروفة حتى وتحتاج إلى تحديدها لتصميم علاج قائم على الدهون ، ابدأ بألواح الدهون المحضرة من خليط جاف من التوازن ، وكميات من الفوسفاتيديل السيين و C 16 سيراميد في 100 ميكرولتر من العازلة العليا. صوتيا لمدة ساعة واحدة بعد إضافة 300 ميكرولتر من عازلة iCal ، مع استكمال 0.1 مللي مولار من كلوريد المنغنيز بالطرد المركزي للعينات عند 12 ، 000 جم لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية ، ثم أعد تعليق حبيبات الحويصلات الدهنية الكبيرة في 100 ميكرولتر من العازلة العليا. أضف نانومولار واحدا من صبغة الفلورسنت DII النابضة بالحياة واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لتسهيل تصور جزء الذئبة الحمراء بعد الفصل الأقصى ، واستعادة حبيبات وردية من الفوسفات الملون بسم داي النابض بالحياة ، وألواح السيراميد السورية عن طريق الطرد المركزي وإنفاق Resus في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت tris.

بعد ذلك ، لإعداد خلية خالية من المنظفات ، قم بتحلل خلايا الصوتنة في 300 ميكرولتر من عازلة مفرطة التوتر من 10 مللي مولار تريس ، كلوريد الهيدروجين الذي يحتوي على مثبطات البروتياز والفوسفاتيز وأجهزة الطرد المركزي. لإزالة الحطام الغشائي ، أضف الآن محللة الخلية الصافية إلى المعلق المادي الدهني واحتضان الخليط لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية. نظرا لأن محللات الخلايا قد تحتوي على أغشية داخلية مع فوسفات إيرين ، فمن المستحسن إزالة المحللة من هذه الأغشية عن طريق خطوات طرد مركزي إضافية.

استكمل خليط التفاعل ب 20 ميكرولترا من مخزن مؤقت ملزم XNV و 50 ميكرولترا من محلول يحتوي على حبات مغناطيسية مترافقة في حضانة XNV لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية ، وقم بإجراء فرز الخلايا المنشطة المغناطيسية على النحو الموصى به في بروتوكول الشركة المصنعة. بعد ذلك ، راقب مضان CM DII النابض بالحياة في التدفق عبر كسور الشطف باستخدام قارئ مضان صفيحة دقيقة لتحديد وجود وكمية الدهون في مقايسة منافسة الأجسام المضادة. للتحقق من خصوصية تفاعل ربط A PKC للسيراميد فوسفو ، تحتضن حويصلات الشين ميكروغراما واحدا من الجسم المضاد متعدد النسيلة للأرانب المضاد ل P KC Zeta مع محللة خلوية لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية ، متبوعا بحضانة الحويصلات الدهنية.

استمر في صفحة SDS وتحليل النشاف المناعي للبروتين المرتبط بألواح سيرين فوسفات السيراميد في أقصى الشطف لإعادة التكوين في المختبر لمركب قطبية البروتين الدهني ابدأ بتحضير الحبيبات الوردية من حويصلات السيراميد الفوسفات المصبوغة بالحياة DII كما هو موضح سابقا ، تعليق الحويصلات في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت الثلاثي ، مكمل ب 100 ميكرومولار جاما S GT P واحد مليمولي ، والناتج المحلي الإجمالي ، ومزيج من البروتينات المؤتلفة ذات الأهمية. ثم احتضان التفاعل عند أربع درجات مئوية لمدة ثلاث ساعات. بعد ذلك ، أضف خمسة ميكرولترات من محلول مخزون 20 × من المخزن المؤقت X in V و 50 ميكرولترا من الخرز المغناطيسي المترافق X في V.

احتضن الخليط تحت التحريك اللطيف لمدة 30 دقيقة أخرى عند أربع درجات مئوية. استمر في إجراء فرز الخلايا المنشطة المغناطيسية NX NV على النحو الموصى به في بروتوكول الشركة المصنعة لتسهيل هطول الأمطار. مكمل جزء الشطف مع 10 ميكروغرام من الألبومين النقي.

تركيز البروتينات عن طريق ترسيب المداخن. تتكون المرحلة السفلية من ميثانول الكلوروفورم مع سم dii نابض بالحياة المخصب يحتوي الطور البيني البني على الخرز المغناطيسي والبروتين المترسب.

قم بتحديد حويصلات ellu الدهنية عن طريق الكشف عن السنتيمتر الوردي النابض بالحياة في مرحلة الميثانول الكلوروفورم العضوي لتفاعل إنفلونزا ويل. استخدم كميات متساوية من الحويصلات الدهنية لتطبيع كميات البروتين بين العينات وتحليلها بواسطة صفحة SDS. نشاف المناعة.

محللة خالية من المنظفات لخلايا MDCK تعبر عن PKC Zetta C كامل الطول المرتبط نهائيا ببروتين فلوري أخضر أو مجال ربط السيراميد. في الطرف C من pkc. تم تحضين زيتا بفوسفو السين.

حويصلات السيراميد بعد elucian من العمود الأقصى ، تم تحليل البروتينات عن طريق النشاف المناعي. تم استرداد جزء ربط السيراميد C 20 Zeta و EGFP و P KC Zeta كامل الطول من EIT للعمود الأقصى ، بما يتفق مع خصوصية وفعالية إجراء lyx. لم يكن من الممكن اكتشاف حويصلات السيراميد السورية الخاصة بنا في الكنترول السلبي ، الذي لم يرتبط بالفوسفات ، في eit.

عندما يتم استكمال Linx بطرق أخرى مثل صفحة SDS والنشاف الغربي أو تحليل البروتينات ، يمكن الإجابة على أسئلة إضافية مثل البروتينات الموجودة في مركب البروتين المرتبط بالدهون. بعد تطويره ، مهد LabX الطريق للباحثين في مجال أبحاث الدهون المفردة S لاستكشاف موت الخلايا المبرمج الناجم عن السيراميد وقطبية الخلايا في الخلايا الجذعية العصبية والخلايا الظهارية.