عالية الإنتاجية قياس وتصنيف ف العضوية في العينات البيئية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصنيف الفوسفور العضوي المتحلل بالإنزيم في مستخلصات التربة أو عينات السماد الطبيعي. يتم تحقيق ذلك عن طريق استخراج العينات أولا بمحلول هيدروكسيد الصوديوم EDTA وضبط درجة الحموضة في المستخلصات. ثم احتضان هذه المستخلصات المعدلة بمحلين مختلفين من الإنزيم.

على صفيحة 96 بئر ، تتمثل الخطوة الأخيرة في قياس أورثوفوسفات الإنزيم المنبعث باستخدام قياس الألوان الأزرق الموليبدينوم. في النهاية ، يمكن تصنيف معظم أشكال الفوسفور أحادي الإستر الأصلية والفوسفور الدياستر في عينات التربة أو السماد بناء على الإطلاق التفاضلي للأورثوفوسفات بطريقة التحلل المائي للإنزيم. يمكن تنفيذ هذه الطريقة بتكلفة زهيدة في أي مختبر قياسي.

الميزة الرئيسية التي تتمتع بها على الطرق الحالية مثل التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي للفوسفور 31 ، هي أنه يمكن قياس إمكانية قيام إنزيمات التربة الأصلية بإطلاق أورثوفوسفات من مركبات البازلاء العضوية في المستقبل. لذلك ، يمكن أن تساعد البيانات التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة في التنبؤ بخصوبة التربة أو إمكانية إطلاق التربة كميات ضارة من الطحالب المتوفرة من الفوسفات. أضف 30 ملليلترا من محلول هيدروكسيد الصوديوم 0.25 مولار إلى جرامين من العينة المبللة أو المجففة في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلترا.

احتضن مع التحريض لمدة 16 ساعة في درجة حرارة الغرفة. الطرد المركزي العينات 3000 مرة G لمدة 30 دقيقة ، ثم انقل 100 ميكرولتر إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر يحتوي بالفعل على عازلة الأسيتات. يبلغ حجم العينة المعدلة مليلتر واحدا ولها درجة حموضة 5.0.

قم بإعداد محلولين للمخزون يحتويان على 0.5 وحدة لكل مليلتر من الفوسفاتيز الحمضي في 10 ملليلتر من أسيتات الصوديوم 0.1 مولار المحضرة حديثا ، ودرجة الحموضة خمسة. أضف الآن نوكلياز المجفف بالتجميد المعاد تكوينه NP واحد من Penicillium Citron إلى أحد أنابيب 10 ملليلتر من مخزونات الفوسفاتيز الحمضية إلى تركيز نهائي قدره 2.5 وحدة NP واحد لكل مليلتر مختلط بلطف عن طريق عكس عدة مرات ، الطرد المركزي محلولي الإنزيم عند 3000 مرة G لمدة 30 دقيقة. من أجل إنشاء منحنى معايرة ، ابدأ بإضافة مليلتر واحد من محلول مخزون فوسفات البوتاسيوم المليمولار إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مليلتر وقم بإجراء سبعة تخفيفات حبوب 0.5 ملليلتر ، وتخلص من الأنبوب الأول بحيث يتراوح التخفيف النهائي من 20 آل إلى 0.625 نانومتر من الفوسفور.

الآن انقل معايير ORTHOPHOSPHATE إلى العمودين الأخيرين على اللوحة ، بدءا من صفر NM orthophosphate في الصف A وانتهاء ب 20 نانومتر من أورثوفوسفات في الصف H إلى الآبار الثلاثة الأولى من العمود 10. أضف 40 ميكرولتر PP بالإضافة إلى محلول إنزيم GP إلى الآبار الثلاثة التالية من العمود 10. أضف 40 ميكرولتر PP بالإضافة إلى GP بالإضافة إلى NP محلول إنزيم واحد.

أخيرا ، أضف 40 ميكرولترا من 100 مللي مولار من الأسيتات إلى جميع الآبار الستة. الآن يجب أن يحتوي كل من الآبار الستة الأولى في العمود 10 على 80 ميكرولترا من المحلول للبئرين التاليين. أضف 40 ميكرولتر من محلول أسيتات الصوديوم الذي يحتوي على 10 ميكرولتر من الجلوكوز وستة فوسفات و 40 ميكرولتر PP بالإضافة إلى محلول إنزيم GP.

لكل عينة يتم اختبارها ، قم بتوزيع 40 ميكرولترا من مستخلصات العينات المعدلة بدرجة الحموضة على الآبار من واحد إلى تسعة في ما يصل إلى ثمانية صفوف بعد توزيع جميع العينات. استخدم ماصة متعددة القنوات لتوزيع محلول إنزيم PP بالإضافة إلى GP على الأعمدة من واحد إلى ثلاثة PP بالإضافة إلى GP بالإضافة إلى NP واحد إلى الأعمدة من أربعة إلى ستة ومحلول أسيتات الصوديوم 0.1 مولار في العمود من سبعة إلى تسعة. قم بتنفيذ هذه الخطوة بسرعة لضمان حصول جميع العينات على وقت حضانة مكافئ.

قم بتغطية لوحة البئر 96 بغطاء واحتضان العينات ومحاليل الإنزيم وأدوات التحكم ومنحنى المعايرة لمدة ساعة واحدة بالضبط عند 37 درجة مئوية في الماء منزوع الأيونات. تحضير 50 مل من كل محلول من حلول المخزون الأربعة. يجب تحضير ماصة يوميا باستخدام ماصة متعددة القنوات بسرعة.

أضف 25 ميكرولترا من SDS و 100 ميكرولتر من المحلول و 20 ميكرولترا من المحلول B و 50 ميكرولترا من المحلول C إلى جميع الآبار في 96. تغطي لوحة البئر الطبق وتحتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أخيرا ، قم بقياس الامتصاص عند 850 نانومتر في أي قارئ صفيحة دقيقة قابل للضبط على شكل حرف T باستخدام تطبيق جدول بيانات.

أولا ، ارسم منحنى معايرة الفوسفور غير العضوي بصفر إلى 20 نانومول فوسفور على المحور x ومتوسط قياسات الامتصاص المكررة على المحور Y ، وقم بإجراء انحدار خطي وابحث عن معادلة الخط الأنسب. بعد ذلك ، احسب الفوسفور غير العضوي في الخلفية عن طريق حساب متوسط القيم في الأعمدة من واحد إلى ثلاثة ، ثم تطبيق منحنى المعايرة على مجموعة البيانات. بعد ذلك لتحديد الفوسفور المشتق من استرات الفوسفور الأحادية المتحللة ، قم بحساب متوسط قيم العينة الثلاثية من الأعمدة من أربعة إلى ستة واطرح محلول إنزيم التحكم بالإضافة إلى الفوسفور غير العضوي في الخلفية.

ثم لحساب محتوى الفوسفور من الفوسفور المتحلل ، تقوم DERs بحساب متوسط قيم العينة الثلاثية من العمود السابع إلى التاسع وطرح محلول إنزيم التحكم بالإضافة إلى الفوسفور غير العضوي في الخلفية بالإضافة إلى الفوسفور أحادي الإستر المتحلل من الأعمدة من أربعة إلى ستة. تظهر لوحة 96 بئر نموذجية نتائج ثماني عينات ومنحنى معايرة. عناصر التحكم موجودة في العمود 10.

ترجع زيادة كثافة اللون بين الأعمدة من واحد إلى ثلاثة وأربعة إلى ستة إلى مركبات الفوسفور أحادية الإستر المتحللة بين الأعمدة من أربعة إلى ستة ومن سبعة إلى تسعة بسبب مركبات الفوسفور المتحللة. هنا تم استخدام طريقة التحلل المائي الأنزيمي عالي الإنتاجية لتحليل توزيع فئات الفوسفور بنجاح في مستخلصات هيدروكسيد الصوديوم 0.25 مولار 0.05 مولار EDTA لعينة تربة فيرمونت. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس مركبات البازلاء الأصلية في التربة أو مستخلصات السماد باستخدام التحلل المائي الأنزيمي.

قد تساعد هذه التقنية في تمهيد الطريق للباحثين في مجالات الكيمياء البيئية وإدارة المغذيات لاستكشاف سلوك الفوسفور العضوي في التربة أو أنظمة السماد الطبيعي.