عالية الإنتاجية قياس وتصنيف ف العضوية في العينات البيئية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصنيف الفسفور العضوي المتحلل إنزيمياً في مستخلصات عينات التربة أو السماد. ويتم تحقيق ذلك من خلال استخلاص العينات أولاً باستخدام محلول هيدروكسيد الصوديوم EDTA وضبط pH المستخلصات. ثم يتم تحضين هذه المستخلصات المضبوطة مع محلولين إنزيميين مختلفين.

في طبق يحتوي على 96 بئرًا، تتمثل الخطوة النهائية في قياس الأورثوفوسفات المتحرر من الإنزيم باستخدام قياس اللون بموليبدينوم الأزرق. وفي نهاية المطاف، يمكن تصنيف معظم أشكال فوسفور أحادي إستر الأورثوفوسفات وثنائي إستر الفوسفور الأصلية في عينات التربة أو السماد بناءً على التحرير التفاضلي للأورثوفوسفات بواسطة طريقة التحلل المائي الإنزيمي. ويمكن تنفيذ هذه الطريقة بتكلفة منخفضة في أي مختبر قياسي.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه الطريقة مقارنة بالطرق الحالية، مثل مطيافية الرنين المغناطيسي النووي للفوسفور 31، في قدرتها على قياس إمكانية إنزيمات التربة الطبيعية لتحرير الأرثوفوسفات من مركبات البازلاء العضوية في المستقبل. وبناءً على ذلك، يمكن للبيانات التي يتم الحصول عليها بهذه الطريقة أن تساعد في التنبؤ بخصوبة التربة أو قدرة التربة على تحرير كميات ضارة من الأرثوفوسفات المتاح للطحالب. أضف 30 milliliters من محلول هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 0.25 molar إلى جرامين من العينة الرطبة أو المجففة في أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter.

يُحضن الخليط مع الرج لمدة 16 ساعة في درجة حرارة الغرفة. تُطرد العينات مركزياً عند 3000 ×g لمدة 30 دقيقة، ثم يُنقل 100 µL إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 mL يحتوي مسبقاً على محلول منظم من الأسيتات. يبلغ الحجم الإجمالي للعينة المعدلة 1 mL وتكون قيمة الـ pH لها 5.0.

قم بتحضير محلولين مركزين يحتوي كل منهما على 0.5 وحدة لكل ملليلتر من فوسفاتيز الحمض في 10 ملليلترات من خلات الصوديوم 0.1 مولار بأس هيدروجيني pH 5 المحضرة حديثاً. الآن، أضف النوكلياز NP1 المجفف بالتجميد والمعاد تشكيله من *Penicillium Citron* إلى أحد أنبوبي مخزونات فوسفاتيز الحمض سعة 10 ملليلتر ليصل إلى تركيز نهائي قدره 2.5 وحدة من NP1 لكل ملليلتر، مع الخلط برفق عن طريق القلب عدة مرات، ثم قم بطرد مركزي لمحلولي الإنزيم عند 3000 ×g لمدة 30 دقيقة. ومن أجل إنشاء منحنى معايرة، ابدأ بإضافة 1 ملليلتر من المحلول المركز لفوسفات البوتاسيوم 1 ملليمولار إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 ملليلتر، وقم بإجراء سبعة تخفيفات تسلسلية بمقدار 0.5 ملليلتر؛ تخلص من الأنبوب الأول بحيث يتراوح مدى التخفيف النهائي من 20 µM إلى 0.625 µM من الفسفور.

الآن، قم بنقل معايير الأورثوفوسفات (ORTHOPHOSPHATE) إلى العمودين الأخيرين في اللوحة، بدءاً من صفر NM من الأورثوفوسفات في الصف A وصولاً إلى 20 nm من الأورثوسفات في الصف H في الآبار الثلاثة الأولى من العمود 10. أضف 40 µL من محلول إنزيم PP زائد GP إلى الآبار الثلاثة التالية في العمود 10. ثم أضف 40 µL من محلول إنزيم PP زائد GP زائد NP الواحد.

أخيرًا، أضف 40 µL من محلول منظم الأسيتات بتركيز 100 mM إلى جميع الآبار الستة. الآن، يجب أن يحتوي كل بئر من الآبار الستة الأولى في العمود 10 على 80 µL من المحلول في البئرين التاليين. أضف 40 µL من محلول أسيتات الصوديوم الذي يحتوي على 10 M glucose وستة فوسفات، و40 µL من محلول إنزيم PP بالإضافة إلى GP.

لكل عينة يتم اختبارها، وزع 40 µL من مستخلصات العينات المعدلة القيمة الهيدروجينية (pH) في الآبار من واحد إلى تسعة في ما يصل إلى ثمانية صفوف بعد توزيع جميع العينات. استخدم ماصة متعددة القنوات لتوزيع محلول إنزيم PP plus GP في الأعمدة من واحد إلى ثلاثة، ومحلول PP plus GP plus NP 1 في الأعمدة من أربعة إلى ستة، ومحلول منظم أسيتات الصوديوم بتركيز 0.1 molar في الأعمدة من سبعة إلى تسعة. نفذ هذه الخطوة بسرعة لضمان حصول جميع العينات على وقت تحضين متكافئ.

قم بتغطية الصفيحة ذات الـ 96 بئراً بغطاء، ثم قم بتحضين العينات ومحاليل الإنزيمات وعناصر التحكم ومنحنى المعايرة لمدة ساعة واحدة بالضبط عند 37 درجة مئوية في ماء منزوع الأيونات. قم بتحضير 50 ملليلتر من كل من المحاليل المخزنة الأربعة. يجب تحضير المحلول A يومياً باستخدام ماصة متعددة القنوات وبسرعة.

أضف 25 µL من SDS و100 µL من المحلول a و20 µL من المحلول B و50 µL من المحلول C إلى جميع آبار طبق الـ 96 بئراً. غطِّ الطبق واتركه للحضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وأخيراً، قم بقياس الامتصاصية عند 850 nm باستخدام أي قارئ ألواح ميكروية قابل للضبط (T tuneable microplate reader) وباستخدام تطبيق جداول بيانات.

أولاً، ارسم منحنى معايرة الفوسفور غير العضوي بحيث يمثل محور x كمية الفوسفور من صفر إلى 20 nanomoles، ويمثل محور Y متوسط قياسات الامتصاصية المكررة، ثم أجْرِ تحليلاً للانحدار الخطي لاستخراج معادلة خط أفضل مطابقة. بعد ذلك، احسب كمية الفوسفور غير العضوي في الخلفية عن طريق حساب متوسط القيم في الأعمدة من واحد إلى ثلاثة، ثم تطبيق منحنى المعايرة على مجموعة البيانات. ولتحديد الفوسفور المشتق من أحادي إسترات الفوسفور المائي، احسب متوسط قيم العينات المكررة ثلاث مرات من الأعمدة أربعة إلى ستة، واطرح منها قيمة محلول الإنزيم الضابط بالإضافة إلى الفوسفور غير العضوي في الخلفية.

بعد ذلك، ولحساب محتوى الفسفور من الفسفور المتمهلج، تقوم DERs بحساب متوسط قيم العينات المكررة ثلاث مرات من العمود السابع إلى التاسع، وطرح محلول الإنزيم الضابط بالإضافة إلى الفسفور غير العضوي الخلفي بالإضافة إلى فسفور المونو إستر المتمهلج من الأعمدة الرابعة إلى السادسة. تظهر لوحة 96 بئراً نموذجية نتائج ثماني عينات ومنحنى معايرة. وتوجد الضوابط في العمود 10.

تعود زيادة كثافة اللون بين العمودين الأول والثالث إلى مركبات الفوسفور أحادية الإستر المتحللة مائياً، وبين العمودين الرابع والسادس والسابعة والتاسعة إلى مركبات الفوسفور ثنائية الإيثر المتحللة مائياً. تم هنا استخدام طريقة التحلل الإنزيمي عالي الإنتاجية لتحليل توزيع فئات الفوسفور بنجاح في مستخلصات هيدروكسيد الصوديوم 0.25 molar و EDTA 0.05 molar لعينة تربة من فيرمونت. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس الأرثوفوسفات الأصلي، ومركبات أحادية الإستر، ومركبات ثنائية الإيثر في مستخلصات التربة أو السماد باستخدام التحلل الإنزيمي.

قد تساهم هذه التقنية في تمهيد الطريق للباحثين في مجالات الكيمياء البيئية وإدارة العناصر الغذائية لاستكشاف سلوك الـ P العضوي في أنظمة التربة أو السماد العضوي.