الحساسية العالية 5 - hydroxymethylcytosine كشفها في أنسجة المخ BALB / C

الهدف العام من التجربة التالية هو تحليل وتقدير كمية 5-methyl cytosine و 5-hydroxyethyl cytosine ضمن موقع محدد من الحمض النووي الجينومي (genomic DNA). ويتم تحقيق ذلك عن طريق حجب مجموعة الهيدروكسيل في 5-Hydroxyethyl Aine، مما يحول موقع MSP one القابل للقطع إلى موقع غير قابل للقطع. وكخطوة ثانية، يتم هضم الحمض النووي الجينومي بواسطة إنزيمات القطع، MSP one و HPA two، والتي تستخدم حساسيتها التفاضلية للمثيلة لتحديد مواقع 5-hydroxyethyl cytosine المرتبطة بالجلوكوز.

يُستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) التالي لاستجواب الموقع الجيني. وتظهر النتائج التي تم الحصول عليها وجود 5-hydroxyethyl cytosine في موقع محدد. ويمكن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (QPCR) لتقدير كمية 5-methyl cytosine و 5-hydroxyethyl cytosine.

تتمثل الميزة الأساسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الأخرى، مثل تسلسل البيسلفيت (bisulfite sequencing)، في القدرة على التمييز بين 5-methylcytosine و5-hydroxyethylcytosine. سيقوم بإجراء التجارب اليوم Romas Vice Villa، وهو المطور الأساسي لهذه المجموعة في New England Biolabs. قبل البدء في هذا البروتوكول، يتم تنقية الـ genomic DNA من أنسجة دماغ B Sea كما هو موضح في الإجراء المكتوب. في أنبوب تفاعل سعة 1.5 milliliter، اخلط الـ genomic DNA وUDP-glucose وNEB buffer 4 وكمية كافية من الماء الخالي من النيوكلياز (nuclease free water) لتصل السعة الإجمالية إلى 310 µL.

قسّم خليط التفاعل هذا إلى أنبوبين، بحيث يحتوي كل منهما على 155 µL. ثم أضف 30 units أو 3 µL من T four beta gluc cosal transferase إلى أحد الأنبوبين. اخلط المزيج جيداً عن طريق السحب والطرد اللطيف باستخدام الماصة.

لا تضف T4 BGT إلى الأنبوب الثاني لأنه يمثل تفاعل الشاهد، ولكن تأكد من إضافة 3 µL من الماء. حضن كلا الأنبوبين عند 37 °C لمدة تتراوح من 12 إلى 18 ساعة، حيث سيقوم BGT خلال هذه الفترة بإضافة الجلوكوز إلى مجموعة الهيدروكسيل في مجموعات 5-hydroxyethyl cytosine الموجودة في العينة. لبدء الهضم بإنزيم التقييد، وزع 50 µL من خليط التفاعل في كل أنبوب من ثلاثة أنابيب PCR شريطية سعة 0.2 mL مرقمة من 1 إلى 3.

بعد ذلك، قم بتوزيع 50 µL من خليط التحكم في كل من ثلاثة أنابيب PCR شريطية مرقمة من أربعة إلى ستة. أضف 100 وحدة من msp، واحدة في الأنبوبين واحد وأربعة. بعد ذلك، أضف 50 وحدة من HPA اثنين في الأنبوبين اثنين وخمسة، ثم اخلط جيداً عن طريق السحب والدفع اللطيف باستخدام الماصة.

لا تضف أي شيء إلى الأنبوبين الثالث والسادس لأنهما يمثلان عينات ضابطة. قم بتحضين جميع الأنابيب الستة عند 37 °C لمدة أربع ساعات على الأقل. بعد ذلك، أضف 1 µL من proteinase K إلى كل أنبوب وقم بالتحضين عند 40 °C لمدة 30 دقيقة.

أخيرًا، قم بتعطيل البروتينيز K عن طريق التحضين عند 95 °C لمدة 10 دقائق. يتم توضيح هذا الإجراء باستخدام NE B'S long amp TAC من أجل PCR النهاية. ومع ذلك، يمكن استبدال كواشف وإجراءات PCR الأخرى في أنبوب تفاعل PCR سعة 0.2 mL على الثلج.

أضف 5x long amp TAC reaction buffer وDN NTPs والبادئات الأمامية والعكسية (forward and reverse primers) والقالب DNA الذي تم الحصول عليه مسبقاً، وlong AMP TDNA polymerase وكمية كافية من الماء الخالي من النوكلييز (nuclease free water) للوصول إلى حجم نهائي قدره 50 microliters. اخلط التفاعل برفق، وإذا لزم الأمر، قم بتجميع كل السائل في قاع الأنبوب عن طريق عملية طرد مركزي سريعة. انقل أنابيب PCR من الثلج إلى جهاز التدوير الحراري (thermocycler) مع تسخين الكتلة مسبقاً إلى 94 degrees Celsius وبدء برنامج الدورات لإجراء عملية PCR روتينية مكونة من ثلاث خطوات.

يجب إجراء خطوة مسخ أولية واحدة عند 94 °C لمدة 30 ثانية، تليها 30 دورة تشمل المسخ عند 94 °C لمدة 15 ثانية، والارتباط عند 55 إلى 65 °C لمدة 30 ثانية، والتمديد عند 65 °C لمدة 20 ثانية أو 50 ثانية لكل kb. ويتبع ذلك خطوة تمديد نهائية واحدة عند 65 °C لمدة خمس دقائق. كما يمكن إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (Realtime PCR) لتقدير كميات 5-methylcytosine و 5-hydroxymethylcytosine.

يرجى الرجوع إلى دليل المنتج الموجود على nb. com للحصول على معلومات محددة. تم إجراء مقارنة لكميات خمسة من hydroxyethyl aine في Locus 12 باستخدام تقنية endpoint PCR و real-time PCR، حيث تم تحليل أربع عينات مختلفة من أنسجة BSY للفئران شملت الدماغ، والكبد، والقلب، والطحال.

يظهر التباين في 5-hydroxyethyl cytosine في مسار الهلام المؤطر لعينات PCR النهائية لأغراض المقارنة. تم تطبيع بيانات PCR في الوقت الحقيقي بالنسبة للحمض النووي غير المقطوع، واستُخدم منحنى قياسي لتحديد عدد النسخ. تم تطبيع العينات عن طريق قسمة عدد نسخ العينات على عدد نسخ الضابط غير المهضوم.

هنا، يمكن ملاحظة التباين في خمسي هيدروكسي إيثيل سيتوزين من خلال مقارنة الأعمدة الصفراء. وفيما يلي بعض الملاحظات حول تنفيذ هذه التقنية؛ فمن الضروري إتمام جميع التفاعلات الإنزيمية بشكل كامل. وبالنسبة لـ BGT، من المهم ترك التفاعل طوال الليل لضمان عزل جميع مواقع DNA لـ Ms.P one و HEPA two، ومن المهم استمرار هذه التفاعلات لمدة أربع ساعات على الأقل للتأكد من وصولها إلى مرحلة الاكتمال.

وأخيراً، نوفر ضوابط DNA وضوابط البادئات لتمكينكم من إجراء تفاعلات الضبط جنباً إلى جنب.