دقيقة وبسيطة قياس الموالية للالتهابات سايتوكاين 1β ايل باستخدام تحفيز الدم الجامعة الفحص

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس السيتوكينات المحرضة للالتهابات التي يتم إنتاجها في مقايسة تحفيز الدم الكامل. أولاً، يتم عزل المكونات الخلوية للدم الكامل عن البلازما عن طريق الطرد المركزي، ويتم تعداد خلايا الدم البيضاء باستخدام صبغة aine orange. بعد ذلك، يتم زرع الخلايا وتحفيزها باستخدام LPS متبوعاً بـ TP لاستحثاث إنتاج السيتوكينات بواسطة الخلايا التي تحمل مستقبلات التعرف على الأنماط الميكروبية، ثم يتم جمع السوائل الطافية للمزرعة في نقاط زمنية محددة بعد بدء التحفيز.

أخيرًا، يتم قياس تركيزات السيتوكينات في السوائل الطافية باستخدام مقايسة مجمعة (multiplex assay) في طبق يحتوي على 96 بئراً. وباستخدام هذه الطريقة البسيطة، يمكن التقييم السريع للاختلافات في تركيزات السيتوكينات المحرضة للالتهابات التي تنتجها الخلايا المحفزة من متبرعين مختلفين. وتعد هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص لتشخيص الأمراض الالتهابية التي يتوسطها IL-1 في المرضى الذين يعانون من مظاهر التهابية مرضية، لا سيما في الحالات التي يكون فيها حجم الدم المتاح محدوداً.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية عند قياس تركيزات السيتوكينات في أن التقنية القائمة على Luminex تتيح القياس المتزامن لعدة سيتوكينات مع استخدام حجم عينة صغير فقط. يتم الحصول على عينات تحتوي على 10 ملليلتر أو أكثر من الدم الوريدي من الأفراد المصابين، وكذلك من مجموعات ضابطة سليمة متطابقة في العمر والجنس، مع التأكد من جمع العينات في أنابيب جمع الدم vacutainer التي تحتوي على هيبارين الصوديوم، وعدم إضافة EDTA أو أي مضادات تخثر أخرى لأنها ستتداخل مع المقايسة، ومعالجة العينات في أسرع وقت ممكن بعد الجمع. وإذا لزم الأمر، يمكن تخزين العينات لمدة تصل إلى 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة تحت ظروف إضاءة خافتة.

قم بطرد عينات الدم مركزياً بسرعة 3000 RPM لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع إيقاف تشغيل المكبح (break). وبمجرد الانتهاء من عملية الطرد المركزي، قم بإزالة البلازما من أعلى الأنابيب مع الحرص على عدم تعكير طبقة الغشاء اللبائي (buffy coat) التي تحتوي على الخلايا أحادية النواة. أعد تعليق الغشاء اللبائي وراسب خلايا الدم الحمراء الموجود أسفله في وسط RPMI خالي من المصل في درجة حرارة الغرفة لغسل الخلايا عن طريق سحب الخليط بلطف باستخدام الماصة.

بعد ذلك، انقُل الخلايا من أنبوب الجمع إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر. أكمل الحجم حتى 50 ملليلتر باستخدام RPMI واقلب كل أنبوب برفق للمزج. قم بطرد الخلايا مركزياً مرة أخرى بسرعة 3000 RPM لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك، يتم سحب السائل الطافي، مع الحرص على عدم تعريض كتلة الخلايا للاضطراب. كرر خطوة الغسل هذه من مرتين إلى أربع مرات لإزالة الملوثات والتخلص من السيتوكينات المرتبطة بالخلايا. وبمجرد غسل الخلايا، أعد تعليقها باستخدام وسط RPMI الخالي من المصل ليصل الحجم الإجمالي إلى 20 milliliters. ولعد الخلايا، ضع 20 microliters من خليط بنسبة واحد إلى واحد من العينة وصبغة Aine orange في غرفة عد Soter ذات الاستخدام الواحد. إن صبغة Aine orange المستخدمة بتركيز نهائي قدره 1 microgram per milliliter ستصبغ فقط خلايا الدم البيضاء ذات النواة، مما يسمح بتمييزها عن خلايا الدم الحمراء.

قم بعدّ الخلايا الإيجابية لـ D فقط بمجرد الحصول على عدد الخلايا. أعد تعليق العينات في وسط RPMI الخالي من المصل للوصول إلى تركيز نهائي قدره 2 مليون خلية لكل milliliter. لكل عينة، قم بتمييز آبار مكررة في لوحة ذات 24 بئراً وفقاً للظروف التجريبية المراد اختبارها.

في هذه الحالة، تكون الظروف هي: غير محفزة، وLPS وحده، وa TP وحده، وLPS بالإضافة إلى a TP. أضف واحد ملليلتر من الخلايا المخففة إلى كل بئر، وأضف LPS إلى الآبار المناسبة بتركيز نهائي قدره واحد ميكروجرام/ملليلتر. قم بتحضين العينات عند 37 درجة مئوية في حاضنة تحتوي على 5% من ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعتين و40 دقيقة. بعد فترة التحضين الأولية هذه، أضف a TP بتركيز نهائي قدره اثنين ملي مولار في الآبار التي تحتوي على A TP وحده والآبار التي تحتوي على LPS بالإضافة إلى a TP. ثم قم بتحضين الأطباق لمدة 20 دقيقة إضافية عند 37 درجة مئوية.

بمجرد اكتمال فترة الحضانة الثانية، انقل الخلايا من كل بئر إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter منفصل ومصنف مسبقاً، ثم قم بطرد العينات مركزياً بسرعة 10,000 RRP M لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة، وبعد ذلك انقل السائل الطافي من كل أنبوب إلى أنبوب EOR جديد ومصنف مسبقاً. يمكن تحليل السائل الطافي للكشف عن السيتوكينات فوراً أو تخزينه مجمداً لتقدير تركيزات IL one beta أو سيتوكينات أخرى. وفي هذه العينات، نستخدم bio plex pro، human cytokine X plex مع نظام Bio Plex 200.

وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. يظهر تحليل إنتاج IL one beta في هذا الشكل عند تحفيز خلايا الدم الكامل الطبيعية باستخدام L-P-S-A-T-P أو كلا المحفزين معاً استجابة لـ LPS plus A TP، والتي تعتمد قوتها على عدد الخلايا التي يتم تحفيزها. وعلى النقيض من الضوابط السليمة، تكشف فحوصات الدم الكامل للمرضى الذين يعانون من أمراض التهابية ذاتية عن زيادة في إنتاج IL one beta بعد التحفيز بـ LPS في غياب a TP المضاف خارجياً. لا تنسَ أن التعامل مع سوائل الجسم البشرية مثل الدم يمكن أن يكون خطيراً للغاية، ويجب دائماً اتخاذ الاحتياطات العامة عند تنفيذ هذا الإجراء.