الديناميكا الحرارية من البروتين للطي غشاء المقاسة بواسطة التحليل الطيفي الإسفار

الهدف العام من التجربة التالية هو قياس الديناميكا الحرارية المرتبطة بطي بروتين الغشاء. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تجميع حويصلات LAR صغيرة لتوفير بيئة طي لبروتين الغشاء. وبمجرد تكوينها، تُستخدم الحويصلات لتحضير عينات تحتوي على البروتين وتركيزات متفاوتة بشكل منهجي من اليوريا.

بعد ذلك، يتم قياس طيف فلورية التريبتوفان لكل عينة. ومن أجل جمع البيانات اللازمة لإنشاء منحنى تفكك بروتين الغشاء، يتم الحصول على نتائج توضح كيفية استخراج طاقة جيبس الحرة لتفكك بروتين الغشاء بناءً على منحنيات التفكك الناتجة عن أطياف فلورية التريبتوفان. مرحباً، اسمي جودي كيم، وأنا أستاذ مساعد في جامعة كاليفورنيا في سان دييغو.

تكشف الطريقة التي ستشاهدونها الآن عن خاصية مهمة للبروتينات الغشائية. وتحديداً، سنوضح لكم كيفية قياس استقرار بروتين مطوي ومدرج في طبقة دهنية ثنائية. اسمي ديانا أوتینجر، وأنا طالبة دراسات عليا في قسم الكيمياء بجامعة كاليفورنيا، سان دييغو.

سنقوم اليوم بتوضيح هذه الطريقة باستخدام بروتين غشائي نموذجي. ومع ذلك، فإن هذه التقنية عامة ويمكن تطبيقها على أنظمة بيولوجية أخرى مثل الببتيدات المرتبطة بالغشاء والبروتينات الذائبة. لذا، لنبدأ العمل.

قبل البدء في هذا البروتوكول، قم بشراء محلول من 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine أو DMPC، وهو ليبيد في الكلوروفورم، وقم بتوزيعه في قوارير زجاجية نظيفة. عند استخدام كميات تبلغ 20 mg لكل قارورة، أضف طبقة من غاز النيتروجين إلى كل قارورة لمنع أكسدة الليبيد ثم أغلق القوارير بإحكام. تُستخدم قارورة واحدة تحتوي على 20 mg من الليبيد في الكلوروفورم لكل تجربة.

لتحضير محلول الحويصلات المخزون، ابدأ بتجفيف محتويات القارورة تحت تيار من غاز النيتروجين لمدة ساعة واحدة، باستخدام سدادة تيفلون وإبر حتىما يتبقى من المذيب. أضف 1 mL من منظم فوسفات البوتاسيوم بتركيز 20 mM و pH 7.3 إلى الدهون المجففة، ثم أعد تعليقها في حمام مائي لمدة 30 ثانية تقريباً. انقل المعلق العكر الناتج إلى أنبوب بلاستيكي سعة 15 mL ذو قاع مخروطي باستخدام ماصة.

أضف ملليلتر واحد إضافي من محلول الفوسفات المنظم إلى القارورة الزجاجية الفارغة التي كانت تحتوي في الأصل على الليبيد، وكرر عملية السونيكاشين. أضف المعلق الناتج إلى نفس الأنبوب سعة 15 ملليلتر. كرر هذه العملية إجمالي أربع مرات للحصول على حجم نهائي قدره 4 ملليلتر وتركيز ليبيد يبلغ 5 mg/mL.

ضع معلق الحويصلات الدهنية في حمام مائي دافئ وقم بعملية السونكة (sonication) باستخدام رأس مجهري للمنظم فوق الصوتي لمدة ساعة واحدة بدورة عمل 50%. يعمل الحمام المائي على منع المحلول الدهني من أن يصبح ساخناً جداً، ويحافظ على درجة حرارة المحلول الدهني المائي فوق درجة حرارة الانتقال الطوري للطبقة المزدوجة أثناء السونكة.

قم بترشيح المحلول الذي تم تعريضه للموجات فوق الصوتية باستخدام مرشح سرنجة بمقاس 0.22 ميكرون لإزالة الشوائب من طرف الماصة، واترك المحلول المُرشح ليتوازن طوال الليل عند 37 درجة مئوية. ولتحضير العينة لعملية طي الفلورسنت الأولية، قم بتحضير محلول مخزون من اليوريا بتركيز 10 مولار في محلول منظم من الفوسفات بتركيز 20 ميلي مولار، ومحلول منظم مخزون من الفوسفات بتركيز 20 ميلي مولار. ووفقاً للبروتوكول المكتوب، يجب تحديد تركيز اليوريا تجريبياً عن طريق قياس معامل الانكسار باستخدام جهاز قياس معامل الانكسار ومقارنته بالقيم المعروفة.

بعد ذلك، قم بتحضير محلول مخزون من البروتين غير المطوي بتركيز 200 micromolar تقريباً من البروتين في 8 molar من اليوريا، و20 millimolar من محلول الفوسفات المنظم. في هذا الفيديو، يتم استخدام بروتين الغشاء OPA A لتوضيح البروتوكول؛ حيث يتم تحضير عينات الدراسات الفلورية عن طريق دمج أحجام مناسبة من محلول البروتين المخزون، ومحلول الدهون المخزون، ومحلول اليوريا المخزون بتركيز 10 molar، ومحلول الفوسفات المنظم المخزون، لتحضير عينات تحتوي على 4 micromolar تقريباً من البروتين، و1 mg/mL من الدهون، ومن 0 إلى 8 molar من اليوريا بزيادات قدرها 1 molar، بحيث يكون الحجم الإجمالي 200 µL. ويتم تحضير العينات الفارغة (Blank samples) بنفس الطريقة.

ومع ذلك، يتم استبدال البروتين بأربعة ميكرولتر من محلول يوريا بتركيز ثمانية مولار. وتُحضّر هذه العينات الفارغة (blanks) بهدف طرح إشارات التشتت والخلفية التي تظهر في أطياف الفلورية للبروتين. يتم تحضين عينات البروتين والعينات الفارغة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين على الأقل قبل قياس أطياف الفلورية.

لضمان الطي الكامل، قم بتشغيل الفلوريمتر قبل ساعة واحدة من بدء القياسات. تلتف بروتينات الغشاء عموماً في الدهون الاصطناعية فقط عندما تكون درجة الحرارة أعلى من درجة حرارة الانتقال الطوري للطبقة الثنائية. لذلك، في حالة DMPC، يتم ضبط درجة حرارة حامل العينة في الفلوريمتر على 30 degrees Celsius.

قم بإعداد تجربة الفلورة باستخدام مقياس الفلورة في الحالة المستقرة، وقم بقياس فلورة التريبتوفان لكل عينة مقابل العينة الضابطة (blank). يجب ضبط طول موجة الاستثارة عند 290 nanometers لتجنب استثارة بقايا التيروزين، وجمع الانبعاث من 305 إلى 500 nanometers. استخدم نطاق تمرير للدخول والخروج بمقدار ثلاثة nanometers.

يمكن تحسين زيادة الطول الموجي ووقت التكامل لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء. القيم النموذجية لزيادة الطول الموجي ووقت التكامل هي 1 nanometer لكل خطوة و 0.5 seconds لكل خطوة على التوالي. قم بسحب 200 µL من العينة بواسطة الماصة ووضعها في أنبوب micro volume fuse silica Q Vet بسعة 160 µL، ثم ضع الـ qve في حامل qve الخاص بالجهاز.

أخيراً، يمكن البدء في قياسات الفلورة عن طريق تحميل ورقة بيانات XY لأطياف الفلورة في برامج مثل Igor Pro أو MATLAB origin أو Excel. وفي هذا العرض التوضيحي، سيتم استخدام برنامج Igor Pro لإزالة خلفية اليوريا والحويصلات الدهنية، وضرب طيف الفلورة للعينة الفارغة في المعامل S، ثم طرح النتيجة من طيف الفلورة الخام لمحلول البروتين والدهون. وعند تركيز اليوريا المقابل، يتم تسجيل الطول الموجي لأقصى فلورة أو lambda max من الطيف المصحح.

لكل تركيز من اليوريا. تبلغ القيمة النموذجية لبروتين غشائي غير مطوي تماماً 350 nanometers. بينما تبلغ قيمة البروتين المطوي 330 nanometers تقريباً، قم بتحويل الأطوال الموجية المدرجة في الجدول إلى كسر غير مطوي عن طريق تحويل نطاق قيم lambda max إلى نطاق يتراوح بين صفر وواحد، وذلك بربط قيمة lambda max بكسر الجمهرة غير المطوية.

ثم قم برسم تمثيل بياني لكسر البروتين غير المطوي مقابل تركيز اليوريا. يمكن ملاءمة الرسم البياني لكسر البروتين غير المطوي F مقابل تركيز اليوريا C مع معادلة تفترض أن البروتين يمكن أن يوجد إما في الحالة المطوية أو غير المطوية. يتوافق المعامل M مع معدل تغير الطاقة الحرة بالنسبة لتركيز المادة الممسوخة، بينما يمثل CM تركيز اليوريا عند نقطة المنتصف التي يتساوى عندها تعداد البروتينات المطوية مع تعداد البروتينات غير المطوية.

R هو ثابت قانون الغازات، و T هي درجة الحرارة بوحدة كلفن. وتؤدي عملية المطابقة إلى الحصول على قيم للمعاملات m و cm.

تُضرب هذه المعاملات لتحديد delta G، وهي طاقة جيبس الحرة لعملية تكشف الطي في غياب اليوريا. ويكشف منحنى تكشف الطي الموصوف عن نطاق تركيزات اليوريا التي تسبب أكبر تغيير في lambda max. وعادة ما يكون هذا النطاق صغيراً، وتحدث غالبية عملية تكشف الطي ضمن هذا النطاق الضيق من أجل التحديد الدقيق للطاقة الحرة لتكشف الطي.

يجب تحليل عينات إضافية في هذه المنطقة للحصول على مخطط يحتوي على نقاط بيانات عديدة، وهي ضرورية لإجراء ملاءمة المربعات الصغرى المحسنة. على سبيل المثال، إذا كان البروتين يتفكك بين 2 و4 molar، يمكن تحضير عينات بين تركيزات اليوريا هذه بزيادات قدرها 0.2 molar للكشف بدقة أكبر عن شكل هذه المنطقة الهامة في منحنى التفكك. وللحصول على أفضل النتائج، يجب تضمين عينة فارغة (blank) عند كل خطوة 0.5 molar على الأقل، وكل خطوة 0.2 molar.

قد تختلف الطاقة الحرة لفك الطي المستمدة من هذا المخطط قليلاً عن تلك المستمدة من منحنى فك الطي الأصلي، ولكنها تعكس قيمة أكثر دقة موضحة. هنا تظهر أطياف فلورية التريبتوفان لبروتين الغشاء التمثيلي om a الذي يحتوي على ثمالة تريبتوفان واحدة. يتم طرح الطيف الفلوري الخام للعينة الفارغة من الأطياف الفلورية الخام للبروتين كما هو موضح في البروتوكول، مما ينتج عنه الطيف المصحح.

تظهر هنا أطياف فلورة التريبتوفان المصححة لبروتين غشائي عند تركيزات متعددة من اليوريا، وذلك وفقاً للطرق الموصوفة. وفي هذا العرض التوضيحي، تم إنشاء منحنى تفكك بناءً على افتراض أن البروتين يكون إما مطوياً أو غير مطوي، وأنه لا توجد حالة مستقرة بينهما. يعكس المعامل M كمية البوليببتيد التي تتعرض للمذيب عند التفكك، بينما تمثل قيمة CM قيمة مهمة تصف تركيز المادة الممسخة المطلوب لتحقيق تساوٍ في تعداد المجموعات المطوية وغير المطوية.

تشير القيم الكبيرة لكل من CM وM إلى استقرار البروتين. وقد حُسبت طاقة جيبس الحرة لعملية فتح الطي لبروتين OPA a باتباع هذا الإجراء. ويمكن استخدام طرق أخرى لفتح الطي، مثل الحرارة، والأس الهيدروجيني pH، وعوامل تغيير طبيعية كيميائية أخرى، لتوفير معلومات مماثلة حول ديناميكا الحرارة لطي البروتين.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس استقرار البروتين بناءً على خصائص الفلورة المختلفة للحالتين المطوية وغير المطوية. بدلاً من ذلك، يمكنك أيضاً إنشاء منحنى عدم الطي باستخدام طرق أخرى مثل التدوير الضوئي (circular dichroism)، طالما أن الطريقة تعطي تقريراً عن تشكيل البروتين، بغض النظر عن الأداة التحليلية التي تختارها. وتتميز طريقة منحنيات عدم الطي بتعدد استخداماتها، حيث يمكن تطبيقها على نطاق واسع من البروتينات الغشائية والبروتينات الذائبة.