كيمياء سيتولوجية مناعية : الخلايا الجذعية العصبية البشرية

مرحبا ، أنا ستيف. أعمل في مختبر الدكتور فلاناغان في قسم علم الأمراض في جامعة كاليفورنيا ، إيرفين. واليوم سأريكم كيفية عمل الكيمياء المناعية لخلايا السلائف العصبية البشرية.

يتضمن هذا البروتوكول وضع الخلايا على زلات غطاء مغلفة ومنع الخلايا واحتضانها في الجسم المضاد الأولي بين عشية وضحاها ، ثم القيام بالعديد من الأجسام المضادة ووضع الجسم المضاد الثانوي وفي درجة حرارة الغرفة. وأخيرا ، ينزلق تركيب الغطاء على رحلات المجاهر. هيا بنا نبدأ.

لذا سأضع أولا ثلاث زلات غطاء زجاجي ألمانية معقمة يبلغ عرضها 12 ملم في صفيحة 24 بئر من أجل تغطيتها بصفح. والآن لدي زلات الغطاء الخاصة بي في اللوحة ، وأولا سأضيف محلولا من PDL بولي ليسين ، وسأحتضن غواصات الغطاء في PDL لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. والآن في نهاية خمس دقائق ، سأقوم بإزالة PDL ووضع اللامينين ، وسأقوم باحتضان زلات الغطاء في صفح لمدة أربع ساعات على الأقل أو أفضل بين عشية وضحاها.

لذلك قمت باحتضان اللوحة طوال الليل في صفح ، والآن سأقوم بشطف زلات الغطاء باستخدام PBS وخلايا السلائف العصبية البشرية التي قمت بحسابها بالفعل. لذلك قمت للتو بإزالة المحاليل الخشبية والآن سأقوم بكبح جماح زلات الغطاء باستخدام PBS. حتى الآن سأقوم بإزالة PBS ووضع حل الوسائط.

وأخيرا ، أنا مستعد لرؤية الخلايا. لذا سأرى الخلايا بمائة ألف خلية لكل مطحنة ، مما يعني أنه بالنسبة لصفيحة 24 بئرا سأضيف 50،000 خلية لكل بئر ، لأن كل بئر يحتوي على نصف مليلتر. لذلك سأقوم بإمالة اللوحة من جانب إلى آخر للتأكد من انتشار الخلايا بالتساوي على سطح زلة الغطاء.

والآن سأضعهم في الحاضنة لمدة 24 ساعة على الأقل للسماح لهم بالاستقرار والانتشار من أجل الكيمياء المناعية. لذا كانت الخلايا تنمو لمدة 24 ساعة ونظرت إليها وهي متصلة ومنتشرة بشكل جيد. حتى الآن سأقوم بإصلاحها بنسبة 4٪ لكل ارتفاع لمدة خمس دقائق.

لكن أولا سأقوم بإزالة الوسائط ولا أريد ترك الخلايا تجف. لذلك سأقوم بإزالة الوسائط وإضافة مثبت في نفس الوقت. لذلك يطلق عليها تقنية اليدين.

لذا سأحتضن الخلايا الآن في المثبت لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. لذلك مرت خمس دقائق. سأقوم بإزالة PFA ووضعه في حاوية نفايات PFA وإضافة PBS في نفس الوقت الذي أقوم فيه بإزالة PFA حتى لا تجف الخلايا.

لذلك سأستخدم إحدى ماصات الشفط البلاستيكية هذه لسحب PFA وسأقوم بضبط المؤقت لمدة خمس دقائق. لذلك أثناء وجود خلاياي في غسيل PBS ، سأقوم بإعداد حل تصور بيرمي باستخدام Triton X 100. إنه منظف غير أيوني ولزج جدا.

لذلك من المهم الانتظار حتى يدخل كل المحلول ويدخل الماصة. لذلك سأقوم بإعداد حل 0.3٪ في PBS ، وسأضيف 10 مل من PBS. وإلى هذه ال 10 ميلات من PBS ، سأضيف 30 ميكرولتر من ثلاثي 100 التالي.

لذلك سأضيف 30 ميكرولترا من الثلاثي بعد 100 إلى 10 مل من PBS. لذلك سأضيف حوالي 10 ثوان للسماح لكل المحلول بالدخول إلى الطرف. لذلك ، لدي هنا حل استخدام perme الخاص بي.

أضعه على المدور لمدة 10 دقائق ، ثم أقوم بتدويره للتأكد من ذوبان التريتون اللزج تماما. حتى الآن أنا مستعد للقيام بخطوة التصور perme. ولذا سأفعل ذلك ، لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

لذلك مرت خمس دقائق. سأقوم الآن بثلاث غسلات PBS مدتها خمس دقائق للتأكد من غسل كل التريتون. لذا مرة أخرى ، سأقوم بضبط الساعة على خمس دقائق.

لذلك ، لقد انتهيت للتو من جميع خطوات الغسيل الخاصة بي ، لذا فأنا مستعد للقيام بخطوة الحظر. لذلك بالنسبة لخطوة الحظر ، قمت بإعداد حل BSA بنسبة 5٪ في PBS. وكما هو الحال مع جميع عمليات الغسيل ، سأقوم بإزالة PBS وإضافة محلول الحظر في نفس الوقت.

وستستمر خطوة الحظر لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. لذلك أثناء انسداد خلاياي ، سأقوم بإعداد اللوحة لحضانة الأجسام المضادة الأولية. لذا سأبدأ بهذه الصفيحة الزجاجية ، وسأقوم بقص قطعة من الفيلم بهذا الحجم تقريبا.

وما سأفعله هو أنني سألفها وأحتاج إلى بعض الشريط ، لذلك سأحتاج إلى أربع قطع من الشريط. لذلك سأقوم فقط بإعدادهم جميعا. لذا سآخذ هذه القطعة من الفيلم الصغير وسأقوم بتصويبها بحيث يكون السطح لطيفا وسلسا.

وبعد ذلك سآخذ كل طرف وألصقه في الجزء الخلفي من اللوحة الزجاجية. لذا سأقوم الآن بسحب هذا الطرف الآخر للتأكد من أن الأسطح مستقيمة ، وسأقوم بلصق الطرف الآخر في الخلف. لذا أحتاج الآن إلى قطعة أخرى من الفيلم الزوجي بنفس حجم الفيلم الأول.

وفي الأساس سأفعل نفس الشيء. لذلك قمت بتسجيل قطعة ثانية من الفيلم فوق الأول ، تماما مثل الأول ، باستثناء أنني تركت أحد طرفي القطعة الثانية من perfil فضفاضا لأنني سأضع محلول الجسم المضاد ثم ينزلق الطاقة على القطعة الأولى. وبعد ذلك سأضع القطعة الثانية فوقها التي تصنع شطيرة.

لكن في الوقت الحالي ، سأقوم بتسمية المكان الذي سأضع فيه محلول الأجسام المضادة وتغطيته. لذا ، كانت الخلايا في محلول الحجب لمدة ساعة الآن ، وسأضع زلات الغطاء على قطرات من الجسم المضاد الأولي للحضانة الليلية الآن. لذلك سأضع قطرة من 35 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي ، وسأكون حريصا جدا على عدم طرد كل السائل لأن ذلك قد يخلق فقاعات وقد تتداخل الفقاعات مع ارتباط الجسم المضاد بالمستضد.

لذلك أريد أن أحاول تجنب وجود فقاعات في القطرة ، جميع القطرات الثلاث من الجسم المضاد الأساسي ، وأنا مستعد لوضع غطاء ، لتغطية الزلات بالخلايا على هذه القطرات. لذا ما سأفعله الآن هو أنني سألتقط قسيمة غطاء. لذا سأقوم أولا بتحريك زلة الغطاء إلى الجانب وأحاول رفعها برفق مع فتح الملقط.

بمجرد أن أشعر أنني حصلت على قبضة زلة الغطاء ، سأقترب لإغلاق الملقط ببطء ورفع زلة الغطاء برفق من البئر. لذا فإن الخلايا الآن أعلى زلة الغطاء. لذا ما سأفعله هو أنني سأقوم بعكس القطرة مقلوبة ولمس القطرة برفق ووضعها ببطء فوق القطرة دون تكوين أي فقاعات.

ولذا سأكرر نفس الإجراء مع زلات الغلاف الثانية والثالثة. والخطوة الأخيرة هي وضع القطعة الثانية من الفيلم في الأعلى. والطريقة التي سأفعل بها هي أنني سأضعها في حركة واحدة من هذا القبيل.

أريد أن أحاول تجنب التحرك وتحريكه من جانب إلى آخر. وأخيرا سأقوم بتثبيته في أسفل اللوحة بقطعة أخرى من الشريط. والآن أخيرا ، الخلايا جاهزة للاحتضان عند أربع درجات بين عشية وضحاها ، وهذه هي نهاية اليوم الأول من الكيمياء المناعية.

هذا هو اليوم الثاني من الكيمياء المناعية ، وسأقوم بغسل زلات الغطاء في PB S3 مرات لمدة خمس دقائق. وبعد ذلك سأحتضن الجسم المضاد الثانوي لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. أولا ، سأقوم بقص الفيلم الصغير بهذه الطريقة حتى أتمكن من إزالة زلات الغطاء.

وسأقوم برفع القطعة العلوية من الفيلم ببطء حتى تظل زلقات الغطاء على القطعة السفلية من فيلم العناية. لذلك قمت بإزالة القطعة الأولى ولدي طبق مع محلول غسيل PBS جاهز. لذلك سأقوم برفع كل حساء غطاء ووضعه في البئر لغسل أي جسم مضاد أساسي متبقي لم يلتصق بالحاتمة.

لذا لرفع زلة الغطاء ، سأمسكها أولا بهذه الطريقة بشفرة حلاقة وأحاول التقاطها برفق. وبما أن الخلايا موجودة ، فإننا نواجه محلول الأجسام المضادة ، سأقوم بقلبها بحيث تكون في الأعلى الآن وقم بتحريكها في البئر بحيث لا يزال هناك في الأعلى. وسأكرر الإجراء الخاص بقلي الطاقة المتبقية.

وهكذا سيتم غسلها لمدة خمس دقائق. لذلك مرت خمس دقائق. سأقوم باستبدال حل PBS.

سأقوم بإضافة الخطافات يموت. الآن سأحتضنها لمدة خمس دقائق. لذا تم الانتهاء من حضانة الخطافات ، والآن أنا مستعد لتركيب غطاء sos وإلقاء نظرة عليهم.

لذا سأقوم أولا ب alk quad vector shield ، مما يساعد على منع الدايمات الفلورية من التبييض. سأقوم أولا بتسمية الشريحة بأرقام زلات الغطاء ، ثم سأضع 10 ميكرولترات من درع المتجه. درع المتجه هو زيت وهو لزج حقا ، لذا من المهم أيضا الانتظار قليلا حتى يدخل كل شيء في الحافة.

لذلك وضعت درعا متجها على شريحة المجهر ، والآن أنا مستعد لوضع زلات الغطاء على شريحة المجهر. لذا ما سأفعله أولا هو أنني سألتقط زلة غطاء وسأشطف الجزء الخلفي من زلة الغطاء بالماء منزوع الأيونات ، لأنني إذا لم أفعل ذلك ، عندما يجف ، فإن الملح الذي كان في PBS سوف يتبلور وسيتداخل مع الخصائص البصرية لقوالب الفلورسنت. لذلك سأذهب إلى ذلك ، لدي مياه منزوعة الأيونات جاهزة.

ولذا سألتقط زلة الغطاء وسأشطف الجزء الخلفي منها بالماء منزوع الأيونات. وبعد ذلك سألمس مسح القصدير لتجفيفه. ثم سأقوم بعكسها مرة أخرى بحيث ينقلب جانب الخلية وينزل إلى شريحة المجهر.

وكما كان من قبل ، سألمس قطرة درع المتجه وأخفضها ببطء دون محاصرة أي فقاعات. وسأكرر نفس الشيء ، نفس الإجراء ، لجميع تقلبات البضائع. والآن دعونا نلقي نظرة.

هذا مثال على ما قد تحصل عليه بعد إجراء الكيمياء المناعية والحصول على صورك وعمل تراكبات وما شابه. إذن في هذه الصورة ، هذه صورة للخلايا الجذعية العصبية للحصين المعزولة من الانبعاج في فئران ما بعد الولادة. أوضحت لكم اليوم كيفية عمل الكيمياء المناعية للخلايا السليفة العصبية البشرية.

وإذا لاحظت ، فإن هذه التقنية تسمح لك بحفظ كاشف الجسم المضاد الموسع. استخدمنا حجما صغيرا جدا من الأجسام المضادة الأولية والثانوية عن طريق وضع قطرة صغيرة على الغطاء وعكس زلة الغطاء مع وجود الخلايا فوقها. لذا استمر ، وقم بإجراء كيمياء العلاج المناعي ، وشكرا لك على مشاهدتي.