A β غلوكورونيداز (GUS) موت الخلية استنادا الفحص

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام نظام مراسل Gus لتحليل خصائص الموت المحتملة لجينات معينة. يتم استنساخ الجينات ذات الأهمية في كاسيت Gus وزراعتها في نواقل البكتيريا الزراعية المناسبة تحت مروج 35 ثانية. ثم يتم تحويل هذه النواقل إلى سلالة Agrobacterium ، LBA 44 0 4 ، ويتم خلطها مع ثقافة تحتوي على كاسيت تعبير Gus للتسلل إلى أوراق Nick Oceana Hamana.

يمكن تقييم نشاط Gus بصريا عن طريق التلوين الكيميائي النسيجي ، أو كميا عن طريق فحص القدح المتري الفلوري. تستخدم الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل سلم الحمض النووي أو مقايسة النفق بشكل شائع في أنظمة الثدييات ، ولكن يصعب تكاثرها في النباتات ، وهي أن هذا اختبار عابر نباتي حساس وسريع يستفيد من الحقيقة البسيطة المتمثلة في أن الخلايا الحية مطلوبة لحدوث تعبير الغاز. وسيكون عرض الإجراء اليوم هو هوا RAOs.

باحث ما بعد الدكتوراه في مختبرنا ، يتطلب التسلل أوراقا صحية موسعة بالكامل لنباتات نيكوتيانا هامانا التي يبلغ عمرها ثلاثة إلى ستة أسابيع ، والتي تزرع عند 25 درجة مئوية. خطط لتنفيذ هذا البروتوكول على مدار ثمانية أيام. في اليوم الأول ، يشتمل الخط مع مخزونات الجلسرين من فاسان الورم الزراعي الذي يحتوي على نواقل مقايسة موت الخلية ، كما أن المتجه مع كاسيت تعبير Gus يشتمل دائما على ناقل فارغ كعنصر تحكم سلبي أو حشو عند اختبار مجموعات ثقافة متعددة.

احتضن الصفائح عند 28 درجة مئوية لمدة يومين. في اليوم الثالث ، قم بتلقيح ملليلترين من LB الانتقائي بمستعمرة واحدة من كل لوحة. احتضان كل مزرعة عن طريق الرج عند 28 درجة مئوية لمدة 24 ساعة عند 200 دورة في الدقيقة حتى الوصول إلى أقصى كثافة نمو.

بعد 24 ساعة من الحضانة ، قم بتعليق المزرعة تماما عن طريق سحب العينات إذا كان هناك تكتل ، وقم بزيادة الحجم الإجمالي لكل مزرعة إلى 10 ملليلتر مع LB الانتقائي الطازج للحث على جينات الفوعة الزراعية. أضف الأسيتون إلى 25 ميكرومولار واحتضان كل مزرعة مع الرج عند 28 درجة مئوية لمدة 16 ساعة أخرى. الخطوة التالية هي الطرد المركزي لكل ثقافة عند 4 ، 000 Gs لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة و Resus ، تعليق الحبيبات في 10 مل من وسط التسلل.

لا تضيف الأسيتون ، الطرد المركزي الثقافات مرة أخرى ، ولكن الآن Resus. كل حبيبات في خمسة ملليلتر من وسط التسلل الذي يحتوي على 100 أسيتون ميكرومولار. الآن قم بقياس OD عند 600 نانومتر.

التركيزات المنخفضة التي تصل إلى 0.1 مقبولة ، ولكن إذا كانت أكبر من 0.9 ، فقم بتخفيفها إلى 0.9 مع التسلل والمتوسط والأسيتون قبل التسلل. احتضان الثقافات مرة أخرى عند 28 درجة مئوية مع الاهتزاز لمدة ثلاث ساعات بعد الحضانة. امزج الثقافات التجريبية وثقافات التحكم بنسبة واحد إلى واحد مع الثقافة التي تحتوي على كاسيت Gus.

لكل ثقافة ، استخدم حقنة بدون إبرة سعة مليلتر واحد للتسلل إلى ختم ABA أو الجانب السفلي من الأوراق الناشئة حديثا. حجم التسلل ليس مهما. عندما تتشكل مساحة نقع الماء بما يكفي ، تسلل إلى كل من التحكم السلبي والجين المراد فحصه على الأوراق المتقابلة في نفس النبات ، ثم تسلل إلى نباتين آخرين بنفس الطريقة.

لذلك هناك نباتات ثلاثية لكل ثقافة. بعد ثلاثة أيام من التسلل ، حان الوقت لجمع الأوراق وفحص التعبير عن بروتين العاصفة. ابدأ التحليل الكيميائي النسيجي عن طريق التسلل بالفراغ إلى الورقة بأكملها باستخدام ركيزة xlu حتى تنقع تماما.

الآن ، احتضان الأوراق في الظلام في درجة حرارة الغرفة طوال الليل أو حتى يظهر تلطيخ أزرق مميز عندما يكون التلوين الأزرق واضحا. اشطف الأوراق بالماء المقطر واحتضانها في 70٪ من الإيثانول طوال الليل حتى تتم إزالة الكلوروفيل. في اليوم التالي ، اشطف الأوراق والماء المقطر وقم بتقييم مستويات تعبير GUS.

لتحديد تعبير Gus ، يتم تحويل كوب الركيزة إلى منتج فلوري مو ، والذي يمكن قياسه بدءا من طحن أقراص الأوراق المتسللة في ملاط باستخدام النيتروجين السائل. ثم أضف 100 ميكرولتر من مخزن استخلاص GUS مع إبقاء العينة على الجليد. الآن قم بالطرد المركزي للتعليق عند 14،000 GS لكل خمس دقائق عند أربع درجات مئوية ، وجمع المادة الطافية التي تحتوي على البروتينات القابلة للذوبان الكلية ، والتي تشمل Gus.

قم بقياس إجمالي تركيز البروتين القابل للذوبان باستخدام NanoDrop واضبط التركيز على 100 ميكروغرام من البروتين الكلي لكل عينة في المخزن المؤقت لاستخراج Gus. الآن ، أضف ركيزة الكوب في مخزن استخلاص Gus إلى كل عينة إلى تركيز نهائي يبلغ اثنين من القدح المليمول. يجب أن يكون الحجم الإجمالي البالغ 100 ميكرولتر لكل عينة كافيا ممزوجا بسحب العينات واحتضان التفاعل لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية.

بعد ساعة ، أوقف التفاعل بإضافة 800 ميكرولتر من العواصف التي توقف العواصف. لتحديد كمية mu ، يتم تحميل 100 ميكرولتر من كل عينة على لوحة ميكروتيتر ، والتي يتم تحليلها في مضان قارئ الألواح عند إثارة 365 نانومتر ، ويتم قياس أطوال موجات انبعاث 455 نانومتر ومقارنتها بمنحنى قياسي ، يمكن بعد ذلك الإبلاغ عن نشاط Guss على أنه M من mu لكل ميكروغرام من إجمالي البروتين القابل للذوبان في الدقيقة. يتم الكشف عن مستويات مختلفة من العاصفة اعتمادا على البنية المستخدمة عندما يتم اختراق كاسيت تعبير GUS مع منظم سلبي لموت الخلية أو جين مضاد للموت.

لوحظت مستويات عالية من الرياح بالمقارنة. مستويات Gus في التحكم في المتجهات الفارغة أقل بكثير. على العكس من ذلك ، عند استخدام منظم إيجابي لموت الخلايا أو جين مؤيد للموت ، لوحظ انخفاض في السوق في تعبير Gus مقارنة بالتحكم في النواقل الفارغة.

بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون أسبوع واحد تقريبا. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن هذه التقنية تستخدم كخطوة أولية لتحديد إمكانات جينات معينة. يجب القيام بعمل إضافي لتأكيد هذه النتائج الأولية وتحديد نوع الخلية المعنية.