PGS السقالات المرنة في هندسة الأنسجة الشرياني
أبريل 8, 2011
قد PGS السقالات المرنة مع خلايا العضلات الملساء الوعائية المستزرعة في مفاعل حيوي يؤدي إلى تدفق نابض بنيات صغيرة قطرها الشرياني واعدة مع انتاج ECM الأم في فترة قصيرة نسبيا الثقافة.
يوضح هذا الفيديو كيفية تصنيع السقالات الأنبوبية المسامية وإخضاعها للتكييف الميكانيكي الديناميكي لهندسة الأنسجة الشريانية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تصنيع السقالات أولا باستخدام المطاط الصناعي القابل للتحلل وطريقة الاندماج الهجومي. ثم يتم تحضير السقالات لتلقيح الخلايا وتجميعها في نظام مفاعل حيوي.
في خلايا العضلات الملساء الوعائية في المفاعل الحيوي بزرع السقالات ويتم زراعتها. بعد أسابيع ، يتم حصاد الأنسجة وتحليلها باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح ، وتلوين h و e والتألق الذاتي للإيلاستين. العضلات الملساء الناتجة متعددة الطبقات وموجهة بشكل عمودي.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية الموجودة مثل تبييض الجسيمات ، هي استخدام القالب الزجاجي لتصنيعها سقالة أنبوبية مسامية وحمض الهيالورونيك. عندما يحذف القالب ، يتم تحضير قالب السقالات من قطعة من الأنابيب الزجاجية. ضع الأنبوب في حامل واسكب محلول حمض الهيالورونيك المحضر في اليوم السابق في الأنبوب.
يتدفق حمض الهيالورونيك ببطء على طول الجدار الداخلي. عندما يصل إلى قاع القالب ، اقلب القالب. كرر هذه الخطوة حتى يتم طلاء الجدار الداخلي للقالب بالتساوي بالمحلول.
بعد الطلاء ، جفف جميع القوالب الزجاجية المحضرة في فرن مفرغ على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. عادة ، يتم تحضير أربعة قوالب بشكل متزامن بينما تجف القوالب الزجاجية. تحضير جزيئات الملح التي تصب وطحنها وجزيئات الملح SVE إلى 25 إلى 32 ميكرومتر.
في اليوم التالي ، قم بتجميع مغزل القالب الزجاجي المحضر ، وأنابيب PTFE ، والأكمام القابلة للتقلص بالحرارة ، وحلقة PTFE. أولا ، قم بتحميل المغزل في أطوال 65 ملم من أنابيب PTFE واخبزها على حرارة 120 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. لتقليص PTFE أثناء انتظار حاضنة تهجين قبل الحرب عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل.
بمجرد أن يغطي الأنبوب المغزل ، ادفع غلاف الانكماش الحراري على المغزل حتى يتحرك بحرية. ثم ضع المغزل داخل القالب الزجاجي وقم بتوصيل حلقة A-P-T-F-E بأسفل المغزل. تأكد من أن حلقة PTFE مناسبة بشكل مريح في الجزء السفلي من القالب الزجاجي.
بعد ذلك ، باستخدام ملعقة وقمع مطاطي من السيليكون ، أضف عصيدة جزيئات الملح إلى القالب الزجاجي. ثم اضغط على القالب برفق باستخدام الملعقة لتوزيع الجسيمات بشكل متساو واكشط الملح الزائد. الآن قم بإيقاف تشغيل الحاضنة الدافئة وتحميلها بسرعة مع القوالب المعبأة بالملح ، سوف يندمج الملح خلال ال 30 دقيقة القادمة ، وبعد ذلك جفف القوالب في فرن مفرغ على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
في اليوم التالي بعد التبريد ، قم بإزالة مغزل الفولاذ المقاوم للصدأ من القوالب عن طريق دفعه للخارج أثناء تثبيت حلقة PTFE. إذا لزم الأمر ، استخدم كماشة أنف إبرة. ثم قم بإزالة حلقة PTFE من قاع القالب.
بعد ذلك ، اخبز القوالب لتقليص الأكمام وإزالة الأكمام المنكمشة من القوالب. اترك القوالب لتبرد حتى يتم استخدامها وقم بتخزينها في مجفف في غطاء المحرك. باستخدام قطارة apo ، قم بزاوية القوالب الزجاجية عند 45 درجة وإسقاط محلول PGS في التجويف الداخلي أثناء تدوير القالب ببطء.
تحقق مما إذا كان محلول PGS يتدفق لأسفل على طول جدار القالب. إذا كانت هناك بقعة جافة ، أضف المزيد من PGS الآن اسمح ل THF بالتبخر في الغطاء لمدة 30 دقيقة على الأقل. بمجرد اختفاء THF ، قم بمعالجة القوالب في فرن مفرغ من الهواء.
بعد المعالجة ليوم واحد ، قم بتبريد القوالب إلى درجة حرارة الغرفة واغمسها ببطء عموديا في الماء منزوع الأيونات عند 24 درجة مئوية. يؤدي قلبها بسرعة كبيرة إلى ظهور فقاعات هواء تمزق السقالة. انقل القوالب بعناية إلى الحمام المائي.
ضعها بزاوية باستخدام أنبوب سيليكون ، واترك حمض الهيالورونيك يذوب على مدار ساعة. إذا لم يتحرر حمض الهيالورونيك من القالب بعد ساعة ، فعندئذ مع استمرار غمر القالب ، استخدم ملعقة لدفع حمض الهيالورونيك ببطء بعيدا عن كلا الطرفين ، ثم هز القالب ببطء. الآن ، تأكد من أن السقالات لم تتحرك داخل القالب الزجاجي ، وإذا كان الأمر كذلك ، اسحب السقالة ببطء باستخدام ملقط لتحريرها من القالب.
بعد ذلك ، قم بترشيح جزيئات الملح عن طريق نقل السقالات الرقيقة بعناية إلى حمام مائي منزوع الأيونات مع التحريك اللطيف. سيستغرق ذلك ثلاثة أيام على الأقل ويتطلب تغيير الماء يوميا بعد ترشيح الملح بالكامل ، انقل كل سقالة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مليلتر مملوء بالماء منزوع الأيونات وقم بتجميدها في صندوق ثلج جاف لمدة ساعة. ضع أنابيب الطرد المركزي المجمدة في مجفف لمدة ثلاثة أيام مع فتح الأغطية.
بمجرد تجميدها ، قم بتخزين السقالات في مجفف حتى يتم استخدامها. ابدأ بقطع السقالات بأطوال 25 إلى 30 ملم. بعد ذلك ، قم بإعداد سدادتين من مطاط السيليكون عن طريق تغذية أنابيب PTFE من خلال الفتحات الوسطى لكل سدادة.
ثم قم بقص طول ملليمتر ونصف من حلقة hs وحرك طولا على أحد طرفي السقالة. ادفع أنبوب PTFE واحدا متصل بالسدادة في نفس نهاية السقالة مع تداخل كاف ليكون تحت حلقة HS لتوصيل السقالة بإحكام بالأنبوب ، وتقليص حلقة HS في الفرن والسماح للتجميع بالتبريد إلى درجة حرارة الغرفة. الآن ، يتم انزلاق أنبوب البولي كربونات مقاس 50 ملم ، والذي يعمل كغرفة المفاعل الحيوي فوق السقالة وتثبيته على السطح الداخلي لسدادة مطاط السيليكون.
تماما كما كان من قبل ، يتم تأمين أنبوب PTFE وسدادة أخرى في الطرف الآخر من السقالة بحلقة hs لإكمال الغرفة. يتم توصيل السدادة الثانية بالطرف الآخر من أنبوب البولي كربونات. بعد ذلك ، يتم توصيل الأسطح الخارجية للسدادات بلوحين من سبائك الألومنيوم.
قم بتغذية قضيبين ملولب في الفتحة الجانبية على كل لوحة وقم بتأمين الألواح بمسامير الإبهام. نعلق سقالة على المفاعل الحيوي. الآن قم بقياس الطول المرئي لكل سقالة ، وهو المسافة بين حلقتين hs ، واحسب مساحات سطحها الداخلية.
لبذر الخلايا. في الأوتوكلاف ، قم بتعقيم الغرف ملفوفة كل منها على حدة بورق الألمنيوم مع كل جزء من وحدة المفاعل الحيوي. بمجرد تعقيمه ، قم بتجميع المفاعل الحيوي داخل غطاء مزرعة الخلية.
قم بمعالجة السقالة مسبقا وشطفها بسلسلة من التروية باستخدام مضخة تمعجية بسرعة ملليمتر واحد في الدقيقة في دائرة التدفق. ابدأ بالشطف بنسبة 70٪ إيثانول و 50٪ إيثانول ثم 25٪ إيثانول لمدة ساعة لكل منهما. اتبع شطف الإيثانول الثلاثة بشطف PBS لمدة ساعتين.
أخيرا ، قم بتدمير المفاعل الحيوي بوسط استزراع SMC لمدة 24 ساعة وبعد ذلك يصبح جاهزا لتلقي الخلايا والتجريب. الآن باتباع التعليمات الواردة في المخطوطة المصاحبة ، قم بزرع المفاعل الحيوي ب 2 مليون خلية لكل سنتيمتر مربع وعلى مدار ال 21 يوما القادمة ، قم بتغيير وسائط الأنابيب وإجراء تعديلات على سرعة المضخة. تدريجيا ، سيزداد الضغط في البناء من حوالي أربعة ملليمترات زئبق في اليوم الأول من الاستزراع إلى أكثر من 100 ملم زئبق بعد أسبوعين في الثقافة ، بعد ثلاثة أسابيع في الثقافة ، حصاد الخلايا وإعدادها للتحليل كما هو محدد في المخطوطة المصاحبة.
تم تصنيع سقالات PGS الأنبوبية هذه بطريقة اندماج الملح. أظهرت الصور المجهرية الإلكترونية الماسحة أن جميع السقالات لها سمك جدار متجانس ولم تكن هناك عيوب جزئية في مقاطعها العرضية. لوحظت المسام الكبيرة والدقيقة الموزعة عشوائيا على السطح اللمعي لجميع السقالات.
بعد زراعة الخلايا ، نمت SMCs متعددة الطبقات باتجاه عمودي لاتجاه التدفق. علاوة على ذلك ، غطت الخلايا وبروتينات DCM تجويف جميع تركيبات PGS بالكامل. أظهر التألق الذاتي للإيلاستين أيضا أليافا مرنة منظمة محيطيا على السطح اللمعي للبناء.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تكون قد فهمت كيفية صنع سقالة أنبوبية مسامية ، وانظر إلى الخلايا وسقالة الثقافة باستخدام مفاعل حيوي مصمم مسبقا.
المحة العامة
توضح هذه الدراسة تصنيع هياكل داعمه أنبوبية مسامية لهندسة الأنسجة الشريانية باستخدام الelastomers القابلة للتحلل الحيوي. يتم زراعة الهياكل مع خلايا عضلة العضلات الوعائية الملساء في مفاعل حيوي ذو تدفق نبضي، مما يؤدي إلى إنتاج المصفوفة الخلاليه الطبيعية في فترة زراعة قصيرة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- هندسة الأنسجة
- المواد الحيوية
- بيولوجيا الأوعية الدموية
الخلفية
- الهياكل الداعمة المطاطية ضرورية لإنشاء هياكل شريانية صغيرة القطر.
- التكييف الميكانيكي الديناميكي يعزز تطور الأنسجة.
- تلعب خلايا عضلة العضلات الوعائية دورًا حاسمًا في دمج الهيكل الداعم.
- إنتاج المصفوفة الخلاليه الطبيعية حيوي لصناعة الأنسجة الوظيفية.
هدف الدراسة
- لتصنيع وتكييف هياكل داعمه أنبوبية مسامية للتطبيقات الشريانية.
- لتقييم حيوية وخاصية خلايا عضلة العضلات الوعائية في الهياكل الهندسية.
- لتقييم إنتاج المصفوفة الخلاليه الطبيعية في بيئة المفاعل الحيوي.
الطرق المستخدمة
- تصنيع الهياكل باستخدام الelastomers القابلة للتحلل وتفتيت جزيئات الملح.
- تكييف ميكانيكي ديناميكي في مفاعل حيوي ذو تدفق نبضي.
- زرع الخلايا مع خلايا عضلة العضلات الوعائية.
- تحليل الأنسجة المحصودة باستخدام مجهر إلكتروني ماسح وصبغة نسيجية.
النتائج الرئيسية
- نجح في تصنيع أنسجة عضلة ملساء متعددة الطبقات وموجهة.
- أظهر تكاملًا فعالًا للخلايا داخل الهياكل الداعمة.
- أنتج هياكل ذات خصائص مصفوفة خلاليه طبيعية هامة.
- أُقيمت طريقة موثوقة لإنشاء هياكل شريانية صغيرة القطر.
الاستنتاجات
- تقدم الدراسة نهجًا واعدة لهندسة الأنسجة الشريانية.
- التكييف الديناميكي يعزز تطور الأنسجة بشكل كبير.
- قد تشمل التطبيقات المستقبلية الترجمة السريرية لزراعة الأوعية الدموية.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Elastomeric scaffold technologies address critical limitations in small-diameter arterial graft development by improving compliance and reducing thrombotic risk. This approach supports predictive confidence in preclinical vascular models through enhanced extracellular matrix deposition and cellular alignment under physiological mechanical conditioning. The method enables mechanistic de-risking of arterial tissue constructs prior to lead identification stages in cardiovascular therapeutic pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of vascular smooth muscle cell responses to elastomeric substrates and dynamic mechanical cues.
- Operational Value: Provides reproducible porous tubular scaffolds with consistent wall thickness for standardized preclinical testing.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable extracellular matrix outputs including elastin autofluorescence and collagen deposition for assay readiness.
- Operational Value: Supports scalable scaffold fabrication via salt fusion method for multi-well or bioreactor-integrated screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates perfusion-conditioned smooth muscle alignment and multilayered tissue formation relevant to native artery morphology.
- Operational Value: Establishes a bioreactor-compatible workflow for longitudinal assessment of graft maturation and mechanical stability.
Pipeline & Workflow Integration
The scaffold fabrication and conditioning process integrates into early discovery workflows by providing compliant, thromboresistant vascular models for target validation and lead optimization in arterial disease programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of elastomeric biomaterials on vascular cell phenotype and extracellular matrix production.
- Screening: Enables standardized assessment of scaffold-cell interactions under pulsatile flow conditions for assay reproducibility.
- Analytics: Delivers quantitative readouts including elastin deposition, cell orientation, and scaffold porosity for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery-stage scaffold maturation to preclinical continuity through native-like tissue development under mechanical conditioning.
- Enterprise Reuse: Positions the salt fusion and bioreactor conditioning method as a reusable platform for multiple vascular tissue engineering initiatives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in graft performance through compliance-matched elastomeric scaffolds and physiological conditioning.
- Operational Value: Standardized, reproducible scaffold fabrication with tunable porosity and thickness for cross-team consistency.
- Strategic Value: Reduced late-stage biological risk via early identification of non-thrombogenic, elastogenic vascular constructs.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of arterial graft candidates based on preclinical extracellular matrix maturation and cellular alignment.
Implementation Considerations
- Requires expertise in biomaterial synthesis, scaffold fabrication, and bioreactor operation.
- Depends on vacuum ovens, perfusion systems, and histological analysis infrastructure.
- Necessitates standardization of salt particle size, PGS solution concentration, and conditioning duration across laboratories.
- Involves adaptation considerations for different cell types or vessel diameters beyond baboon smooth muscle cells.
- Practical limitations include multi-day salt leaching and lyophilization steps affecting throughput.
