تعيين تركيز الأحماض النووية والبروتينات باستخدام الصغرى ، حجم الطيف نانو بيو المواصفات

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد تركيزات الأحماض النووية والبروتينات بدقة وبطريقة قابلة للتكرار باستخدام مقياس الطيف الضوئي للمقادير الدقيقة. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال اختيار طول المسار المناسب للعينة المراد قياسها. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في قياس العينة الفارغة (blank).

بعد ذلك، يتم قياس عينة DNA أو البروتين. وتتمثل الخطوة النهائية من الإجراء في حفظ البيانات بتنسيق PDF أو CSV. وفي النهاية، يتم الحصول على نتائج عالية التكرار لكل من DNA والبروتين.

يمكن الحصول على القياس الكمي بسرعة ودقة بواسطة هذه الطريقة. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في كونها سريعة ودقيقة وقابلة للتكرار. لبدء إجراء التحديد الكمي لـ DNA، قم بتشغيل مقياس الطيف الضوئي BIOS spec nano.

افتح برنامج BIOS spec nano من سطح مكتب الكمبيوتر. انقر فوق علامة تبويب simple nucleic acid D-S-D-N-A. سيقوم البرنامج بإنشاء اتصال مع الجهاز وتشغيل تسلسل التهيئة.

يؤكد هذا أن الجهاز يعمل وفقاً للمواصفات. بعد ذلك، حدد طول المسار. من خلال شريط تمرير طول المسار.

تتوفر ثلاثة خيارات لعينات ذات حجم ميكرولتر. يمكن استخدام 0.2 ملليمتر أو 0.7 ملليمتر. وبالنسبة للعينات المخففة، يوجد خيار لاستخدام كوفيت بطول مسار يبلغ خمسة ملليمتر.

في هذا العرض التوضيحي، تم اختيار 0.7 millimeters لقياس عينة بحجم 2 µL. وتعتمد جميع الحسابات على طول المسار الذي تم اختياره. بعد ذلك، انقر في البرنامج على علامة تبويب الإعداد (setup) واختر إعداد المسح التلقائي (auto wiping setup).

اختر واحدة لمسحة واحدة. قبل قياس العينة، أو في كل مرة يتم فيها اختيار طول مسار جديد، يلزم إجراء قياس للفراغ (blank). بالنسبة لطول مسار 0.7 millimeter، ضع 2 µL من الماء أو المحلول المنظم على القاعدة. انقر فوق blank لإجراء قياس الفراغ.

ستتحرك النافذة العلوية لتحقيق التلامس مع قطرة العينة، ويمكن ملاحظة ومضات الزينون. وعند اكتمال القياس، ستقوم الممسحة بمسح العينة تلقائياً. الآن يمكن قياس العينة.

من المهم استخدام محلول عينة متجانس، حيث أن وجود جزيئات غير ذائبة في العينة سيؤدي إلى نتائج غير قابلة للتكرار. ولتجنب إدخال فقاعات الهواء، يتم سحب 2 µL من العينة بعناية، ثم وضع العينة بشكل متجانس من طرف الماصة على القاعدة.

اضغط على زر البدء في الجهاز. كما حدث سابقاً، ستتحرك النافذة العلوية لتلامس قطرة العينة، ويمكن ملاحظة ومضات زينون؛ ولتحديد مدى قابلية التكرار، كرر قياس العينة نفسها ثلاث مرات، حيث يتم حفظ جميع البيانات المسجلة تلقائياً كملف BUD. وللحفظ بتنسيق PDF أو CCSV، انقر فوق save P-D-F-C-S-V.

يمكن أيضاً حفظ النتائج كملف CSV عن طريق استخدام الاختيار المناسب في علامة تبويب الحفظ. ويمكن إجراء تقدير كمية البروتين باستخدام طريقة الامتصاصية عند طولين موجيين (80 method). ولتقدير كمية البروتين، اختر علامة تبويب تقدير كمية البروتين.

أدخل معامل الامتصاص epsilon 280 إذا كان معروفاً؛ وفي حال عدم معرفة Epsilon 280، قم بحسابه باستخدام Epsilon 280 calc. حدد 0.2 millimeters في شريط طول المسار لقياس عينة بحجم 3 µL. بعد ذلك، انقر فوق علامة تبويب الإعداد (setup) في البرنامج واختر إعداد المسح التلقائي (auto wiping setup). اختر الرقم 2 لإجراء عمليتي مسح لمنع أي انتقال للمواد بين العينات ولضمان دقة القراءة.

لقياس الماصة الفارغة، ضع ثلاثة ميكرولتر من الماء أو المحلول المنظم على القاعدة، ثم انقر فوق "blank" لإجراء قياس الفراغ. بعد ذلك، قم بسحب ونقل ثلاثة ميكرولتر من عينة البروتين بعناية على القاعدة. وللبدء في قياس العينة دون إدخال أي فقاعات هوائية، انقر فوق "start" في البرنامج أو اضغط على زر البدء في الجهاز.

كرر قياس العينة نفسها ثلاث مرات لتحديد قابلية التكرار الموضحة. فيما يلي بيانات من قياسات أجريت على عينة نموذجية من DNA مزدوج السلسلة. الصيغة المستخدمة لحساب تركيز DNA هي أن تركيز العينة يساوي DF مضروباً في كمية OD 260 ناقص OD 320 مضروباً في NACF، حيث يمثل DF عامل تخفيف العينة ويمثل NACF عامل تركيز الحمض النووي.

يتم ضبط عامل تركيز الحمض النووي وفقاً للمادة المقيّسة المختارة. ويتم توضيح تركيز الحمض النووي المحسوب ونسبة OD 260/280. يحتوي هذا الجدول على نتائج اختبار التكرارية لتقدير كمية DNA.

تُظهر البيانات مجتمعة نتائج عالية القابلية للتكرار، وهو ما يتضح من انخفاض الانحراف المعياري النسبي الذي بلغ 0.26%. وتُعرض هنا نتائج نموذجية لتحليل تركيز البروتين لـ BSA. ويعتمد تركيز البروتين بالميكروغرام لكل مليليتر على قيمة Epsilon two 80. وأخيراً، يوضح هذا الجدول تحليلاً لقابلية تكرار التقدير الكمي للبروتين.

يشير الانحراف المعياري النسبي البالغ 0.51% إلى أن جهاز BIOS spec nano يقيس od بدقة ليس للحمض النووي DNA فحسب، بل للبروتينات أيضاً. وبمجرد إتقان هذه الطريقة، يمكن تحليل عينات متعددة في دقيقة واحدة.