الاستقطاب إزفاء من البروتينات في نيون القيطم الأدمة في الاستجابة لاشارة Wnt

الهدف العام من هذا الإجراء هو فحص التغيرات في التموضع تحت الخلوي للبروتينات عند تفعيل إشارات عامل النمو. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق حقن أرومات حيوانية من أجنة xenopus المبكرة بـ RNAs تشفر RFP المتنوع ومستقبل الإشارات FRIZZLED eight. بعد ذلك، يتم تحضير غرسات جلدية كهربائية و/أو مقاطع تجميدية للجنين ثم تُصبغ مناعيًا.

أخيرًا، يتم تصوير الخلايا المصبوغة مناعيًا باستخدام مجهر فلوري. وفي نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج توضح كيف يعتمد التوضع تحت الخلوي لبروتين معين على مسارات الإشارات الجنينية. وعلى سبيل المثال، نوضح أن diverse يتم استقدامه من الجسيم المركزي إلى غشاء الخلية بواسطة مستقبل FRIZZLED eight.

تتيح هذه الطريقة للباحثين تصور التموضع تحت الخلوي لبروتينات الإشارات في الجسم الحي باستخدام أجنة Xenopus. ويمكن أن يساعد ذلك في معالجة أسئلة جوهرية في بيولوجيا التطور والخلية، مثل دراسات التنظيم المكاني للإشارات وآليات أولوية الخلايا. لبدء عملية الإخصاب في المختبر، يتم الحصول على البويضات من إناث الضفادع التي حُقنت بهرمون موجّه الغدد التناسلية المشيمية البشري.

قبل التجربة بـ 12 ساعة، أضف 0.5 إلى 1 مل من محلول ماركس رينجر المعدل (Marx modified ringer solution) بتركيز 1X إلى البيوض، ثم قم بتخصيبها في المختبر باستخدام قطعة صغيرة من الخصية المشرحة. بعد دقيقتين إلى ثلاث دقائق، خفف تركيز الملح باستخدام محلول MMR بتركيز 0.1X لتنشيط حركة الحيوانات المنوية. ثم تُحضن لمدة 20 دقيقة.

عند الإخصاب، تتجه البويضات بحيث تكون أقطابها الحيوانية للأعلى. قم بإزالة الغشاء الهلامي للبويضة باستبدال محلول MMR بمحلول سيستين بتركيز 3% في الماء لمدة خمس دقائق. اغسل البويضات ثلاث مرات باستخدام محلول 0.1 XMMR.

تُحضن الأجنة عند درجة حرارة 13 °C حتى تصل إلى مرحلة الخليتين إلى أربع خلايا. بعد ذلك، تُنقل الأجنة إلى 3%fi. Call في 0.5 XMMR من أجل الحقن المجهري.

قم بتخليق جزيئات الـ RNA من قوالب DNA خطية باستخدام طقم M message M machine، ثم خففها باستخدام مياه خالية من الـ RNase لتصل إلى تركيز يتراوح بين 0.1 إلى 1 ميكروجرام لكل ميكرولتر (µg/µL). تُستخدم جزيئات الـ RNA الخاصة بـ RFP المتنوعة، وعلامة الغشاء GFP CX وFRIZZLED 8 بتركيز يتراوح بين 0.1 إلى 1 نانوجرام لكل عملية حقن. قم بتجهيز إبر الحقن من أنابيب شعيرية باستخدام جهاز سحب الإبر (needle pull) وجهاز طحن الإبر (needle grinder) قبل البدء في عملية الحقن.

قم بمعايرة كل إبرة باستخدام الماء لحقن 10 لترات من السائل في كل عملية حقن. ضع الأجنة فوق طبق بلاستيكي داخل قطرة كبيرة من 3%fial 0.5 XMMR. اسحب ميكرولتر واحد من محلول RNA إلى إبرة حقن باستخدام حقنة دقيقة shige ضيقة.

احقن 10 nanoliters من RNA في كل من انفجارين حيوانيين لجنينين في مرحلة الخليتين. انقل الأجنة المحقونة إلى بئر في طبق يحتوي على 12 بئراً، وتحضنها عند 13 °C حتى تصل إلى مرحلة بداية تكوين المعيدة.

انقل الأجنة في مرحلة التكوين المعدي المعوي (gastro stage) إلى محلول 0.6 XMMR في طبق بلاستيكي بقطر ستة سنتيمترات مطلي بـ 1% aeros. أزل الغشاء المحي وهو (vitel membrane) يدوياً باستخدام الملقط. ثم استخدم إبرة tsin وحلقة شعر لاستئصال مستنبتات من الأديم الظاهر (ectodermal explants) من الأجنة.

قم بتثبيت العينات في 3.7%formaldehyde في PBS لمدة 30 دقيقة. اغسل X explan ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة باستخدام PBS. ولصبغ النوى، أضف davi إلى الغسلة الثالثة.

بعد ذلك، قم بتثبيت X explan على شريحة زجاجية عن طريق وضعه بين شريطي شريط لاصق، بحيث يكون الجانب الداخلي غير المصبوغ من X explan مواجهاً للعدسة الشيئية. أضف قطرتين إلى ثلاث قطرات بحجم 20 µL من محلول التثبيت. ثم ضع غطاء الشريحة في الأعلى.

يمكن إجراء تقطيع تجميدي للأجنة المحقونة لتصور توزيع البروتينات الفلورية في الخلية ولإجراء صبغ مناعي باستخدام أجسام مضادة محددة. في المرحلة 10، يتم تثبيت الأجنة لمدة تتراوح بين ساعة إلى ساعتين في درجة حرارة الغرفة باستخدام مثبت كثيف في قارورة زجاجية سعة 4 mL. بعد ذلك، وبعد الغسل في PBS، يتم تضمين الأجنة في محلول مكون من 15% جيليتين سمكية و 15% سكروز في القارورة نفسها.

في اليوم التالي، انقل الأجنة المدمجة إلى قالب بلاستيكي. قم بتجميد الأجنة المدمجة سريعاً على الثلج الجاف. ثم قم بتجهيز المقاطع المجمدة باستخدام جهاز الميكروتوم المجمد (cryostat).

قم بإجراء صبغ مناعي فلوري على المقاطع، وثبّت الشرائح وصور الأجنة المقطعية عرضياً باستخدام نفس الطريقة الموصوفة لغرسات الأديم الظاهر. اجمع الصور باستخدام مجهر فلوري Zes Axio plan مع المرشحات المناسبة وتحديد وتصوير مستويات Z محددة ضمن المستوى X. في هذا الشكل، يتركز ersin في الجسيم المركزي في خلايا الأديم الظاهر، بينما ينتقل trans إلى غشاء الخلية.

استجابةً لـ Frizzled eight، يعمل cex GFP على وسم غشاء الخلية باللون الأخضر. ويظهر Diverse in RFP باللون الأحمر، بينما تظهر النوى الموسومة بـ DPI باللون الأزرق هنا. يتم استقطاب Diverse in RFP إلى غشاء الخلية بواسطة Frizzled eight في المقاطع المجمدة للجنين.

يُعد غاما توبولين (Gamma tubulin) علامة للجسم المركزي. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لفائدة أجنة XUS والخلايا الجنينية لدراسات استقرار البروتينات وعمليات التأشير بدقة فرعية.