تحديد أنواع غشاء الميتوكوندريا المحتملة والأوكسجين التفاعلي في الخلايا العصبية الفئران الحية القشرية

الهدف من هذا الإجراء هو تحديد إمكانات غشاء الميتوكوندريا ومستويات أنواع الأكسجين التفاعلية في الخلايا العصبية القشرية الأولية باستخدام مجسات الفلورسنت و TMRM و H 2D CFD على التوالي. يتم تحقيق ذلك عن طريق إعداد المخزون أولا وتركيزات العمل ل TMRM و H 2D CFDA. الخطوة الثانية هي احتضان الخلايا العصبية القشرية باستخدام TMRM و H 2D CFDA في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة في عازلة الطرق التايلاندية.

الخطوة الثالثة هي تصوير شدة التألق ل TMRM و DCF في الخلايا العصبية القشرية الحية باستخدام انبعاث الإثارة 5 15 5 17 نانومتر و 4 88 5 15 نانومتر على التوالي. ستتم مراقبة التغييرات في TMR في التألق في وجود الميتوكوندريا unco FCCP ، بينما ستتم مراقبة التغييرات في مضان DCF في وجود بيروكسيد الهيدروجين. الخطوة الأخيرة من هذا الإجراء هي جمع البيانات وتطبيعها وتحليلها.

في النهاية ، يتم الحصول على النتائج عن طريق رسم رسم بياني يوضح المستويات النسبية لكثافة مضان TMRM و DCF قبل وبعد معالجة FCCP وبيروكسيد الهيدروجين على التوالي. مرحبا ، أنا جوانا كوسكا. مرحبا بكم في مختبري في جامعة لويولا في شيكاغو.

سنوضح لك اليوم كيفية قياس إمكانات غشاء الميتوكوندريا وأنواع الأكسجين التفاعلية في الخلايا العصبية القشرية للفئران. سيتم توضيح الإجراء بواسطة dhi. مرحبا ، أنا دي دينيس جوسي.

باستخدام هذا الإجراء ، يمكن قياس إمكانات غشاء الميتوكوندريا على ملصق الميتوكوندريا الفردي وأنواع الأكسجين التفاعلية في ملصق الخلية الواحدة. لذلك دعونا نبدأ. قم بإعداد مخزون 10 ملليمولار من TMRM عن طريق إذابة خمسة ملليغرامات من TMRM في مليلتر واحد من دوامة أكسيد ثنائي ميثيل كبريت اللامائية لمدة دقيقة واحدة.

ثم اجعل الحصص تخزن الحصص عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. يحفظ من الضوء ويستخدم في غضون شهر واحد. بعد ذلك ، قم بإعداد مخزون 10 ملليمولار من H 2D CFDA عن طريق إذابة 4.87 ملليغرام من H 2D CFDA في مليلتر واحد من أكسيد ثنائي ميثيل كبريت اللامائي

وبالمثل ، قم بالدوامة لمدة دقيقة واحدة ، ثم قم بعمل حصص وتخزينها عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر. حماية من الضوء واستخدامها في غضون أسبوع واحد لتحميل الخلايا العصبية القشرية للفئران مع TMRM أولا. اغسل الخلايا العصبية المزروعة ثلاث مرات باستخدام المخزن المؤقت لتايرو.

ثم قم بإعداد 20 نانو مولار TMRM عن طريق تخفيف مخزون TMRM 10 مللي مولار 1000 مرة في السل. ثم أضف ميكرولترين من TMRM المخفف لكل مليلتر واحد من السل. احتضان الخلايا العصبية باستخدام TMRM لمدة 45 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.

بعد 45 دقيقة ، قم بتركيب طبق الثقافة على مسرح المجهر وابدأ في التصوير لتحميل الخلايا العصبية القشرية للفئران ب H 2D CFDA ، واغسل الخلايا العصبية المزروعة ثلاث مرات بالسل. بعد ذلك ، قم بإعداد اثنين من الميكرومولار من H 2D CFDA عن طريق تخفيف مخزون H 2D CFDA 10 مللي مولار 10 مرات في السل. ثم أضف ميكرولترين من H 2D CFDA المخفف لكل مليلتر واحد من السل.

ثم احتضان الخلايا العصبية باستخدام H 2D CFDA لمدة 45 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة بعد 45 دقيقة. اغسل الخلايا العصبية أربع مرات بالسل لإزالة مؤشر الفلورسنت الزائد قبل الحصول على الصور لإجراء تصوير مباشر للخلايا العصبية المحتضنة باستخدام الفحص المجهري للمسح بالليزر متحد البؤر TMRM مع تطبيق برنامج السلسلة الزمنية الحية. قم بتطبيق دقة منخفضة وطاقة ليزر مخففة لتقليل الوقت اللازم للحصول على الصور وتجنب تبييض الصور.

بعد ذلك ، اضبط تركيز الخلايا العصبية المثبتة المحملة ب TMRM باستخدام الضوء المنعكس. افحص مضان TMRM عن طريق الإضاءة عند خمسة 14 نانومتر والكشف عند خمسة 70 نانومتر. اضبط كسب الكشف للكاميرا أسفل مستوى التشبع مباشرة بمجرد تعيين جميع المعلمات ، والتي تشمل الدقة واكتشاف طاقة الليزر وكسب الكاميرا والفاصل الزمني للحصول على الصور.

لا تغير هذه الإعدادات بين التجارب. بعد ذلك ، قم بتغيير الحقل. ابدأ في جمع الصور لاختبار التغييرات في محفز دلتا PSY M ، مثل يمكن تطبيق ميكرومولار واحد من FCCP أو ميكروغرامين لكل مليلتر من oligo mycin ، مما يؤدي إلى إزالة الاستقطاب أو فرط استقطاب إمكانات غشاء الميتوكوندريا على التوالي.

ستنعكس هذه التغييرات من خلال انخفاض في شدة مضان TMRM مقارنة بكثافة التألق الأساسية في حالة FCCP أو زيادة في شدة مضان TMRM. في حالة خطيئة LIGA myin لإجراء تصوير حي للخلايا العصبية المحتضنة ب H 2D CFDA أولا قم بتركيب طبق الثقافة على مسرح المجهر ، واضبط تركيز الخلايا باستخدام الضوء المنعكس. افحص مضان DCF عن طريق الإثارة عند 4 88 نانومتر والانبعاث عند خمسة 15 نانومتر.

بعد ذلك ، اضبط طاقة الليزر على خمسة إلى 7٪ اكتشف الكسب والدقة 2 56 × 2 56. لا تغير هذه الإعدادات بين التجارب. ثم اضبط التردد للحصول على صور حية.

باستخدام برنامج السلسلة الزمنية ، حدد حقلا جديدا وابدأ في الحصول على الصور لاكتشاف التغييرات في مستويات R OS. عالج الخلايا ب 100 إلى 200 ميكرومولار من بيروكسيد الهيدروجين. سينعكس ذلك من خلال زيادة في شدة مضان DCF مقارنة بمستوى خط الأساس.

استخدم أداة منطقة الاهتمام من برنامج LSM لتحديد المناطق. ثم حدد عائد الاستثمار من مناطق الميتوكوندريا أو عائد الاستثمار من جسم الخلية بالكامل في خلايا الصورة. لقياس شدة التألق ل TMRM أو ROS على التوالي.

حدد المناطق بجوار الخلايا. لحساب شدة مضان الخلفية ، قم بإجراء العديد من القياسات ولحساب متوسط شدة الخلفية ، اطرح متوسط شدة مضان الخلفية من متوسط شدة التألق للمناطق ذات الأهمية في كل خلية لكل نقطة زمنية باستخدام Microsoft Excel. بعد طرح شدة الخلفية ، قم بتطبيع شدة مضان TMRM أو DCF إلى مضان خط الأساس.

باستخدام هذه الصيغة ، استخدم برنامج مخطط سيجما لإنشاء المؤامرة التي توضح التغيرات في شدة التألق بمرور الوقت. فيما يلي مثال على صورة مضان للخلايا العصبية القشرية للفئران المحتضنة باستخدام TMRM. تؤدي إضافة F-C-C-P-A الميتوكوندريا إلى إزالة استقطاب الميتوكوندريا وفقدان شدة مضان TMRM.

يظل مستوى مضان TMRM الأساسي مستقرا قبل إضافة FCCP. يظهر التحليل الكمي لتغيرات مضان TMRM بمرور الوقت انخفاضا كبيرا في مضان TMRM بعد إضافة FCCP. فيما يلي مثال على صورة مضان للخلايا العصبية القشرية للفئران المحملة ب DCF.

يظل مستوى مضان DCF الأساسي دون تغيير في أول 120 ثانية قبل تطبيق بيروكسيد الهيدروجين. تؤدي إضافة بيروكسيد الهيدروجين إلى زيادة شدة مضان DCF في أجسام الخلايا. تظهر قياسات الفاصل الزمني لمضان DCF مستوياته الثابتة التي زادت بعد معالجات بيروكسيد الهيدروجين.

في هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر استخدام طاقة ليزر منخفضة وسرعة مسح سريعة لتجنب القطع الأثرية من تبييض الصور والسمية الضوئية. حظا سعيدا في تجربتك.