جهاز لتوليد التدرج ميكروفلويديك لبيولوجيا الخلية

اسمي جيانغ، وأنا زميل باحث في جامعة هارفارد ومعهد ماساتشوستس للتكنولوجيا (MIT)، قسم العلوم والتكنولوجيا الصحية. واسمي أمير مانشي، وأنا طالب جامعي في مختبر البروفيسور حسن في جامعة هارفارد ومعهد ماساتشوستس للتكنولوجيا (MIT)، قسم العلوم والتكنولوجيا الصحية.

توضح هذه الشريحة المخطط الإجرائي لكيفية تصنيع الجهاز؛ حيث قمت بطلاء SUA 50 بطريقة الطلاء الدوراني فوق silicone vapor، ثم وضعت قناعاً فوق silicone vapor، تلا ذلك التعريض للأشعة فوق البنفسجية (uuv exposure) ثم التحميض. وبذلك يمكننا في النهاية الحصول على هذه الوسادات ووضعها على silicone vapor. بعد ذلك، يمكننا صب PDMS، ثم القيام بعمليتي التجفيف والخبز، وإجراء ثقب صغير، ومن ثم يمكننا دمج الجهاز عن طريق الربط بين جهاز PDMS وشريحة الزجاج باستخدام بلازما الأكسجين.

حسناً، نحن الآن في غرفة التصنيع الدقيق داخل المختبر وسنبدأ بصنع بعض طبقات PDMS. ما أعنيه بـ PDMS، هو المصطلح العلمي الفعلي polymethyl siloxane، وهو بوليمر عضوي. ويعد هذا البوليمر العضوي القائم على السيليكون الأكثر استخداماً على نطاق واسع.

في الواقع، هي عبارة عن خليط من مادتين مختلفتين، حيث تتكون من قاعدة إيلاستومر السيليكون وعامل معالجة إيلاستومر السيليكون. وتكون النسبة 10 من القاعدة إلى جزء واحد من عامل المعالجة. لذا، نحتاج إلى حوالي 10 gram من القاعدة، وبناءً على ذلك نحتاج إلى حوالي 1 gram من عامل معالجة الإيلاستومر، وسأقوم بخلط هذه القاعدة مع عامل المعالجة حتى يتجانسا معاً.

سأستخدم الماصات. والآن بعد أن أصبح الخليط جاهزاً، سأقوم بصبه فوق رقاقة السيليكون. تكمن الفكرة في أن رقاقات السيليكون هذه تحتوي على بعض الأنماط على سطحها.

تساعد هذه الخطوات بوليمر PDMS فعلياً في اكتساب النمط المطلوب، ونستخدم هذه الأنماط لإنشاء قنوات وأخاديد أو أي نمط آخر نحتاجه على هذه البوليمرات. وبما أن هناك العديد من الفقاعات داخل هذا المزيج، فإن الخطوة التالية هي محاولة وضعه تحت تفريغ هوائي لتجنب وجود تلك الفقاعات داخل البوليمر الخاص بنا. سأقوم بوضع هلامات PDMS على رقاقة السيليكون داخل غرفة التفريغ.

سأقوم بإغلاق الغرفة ثم تفعيل تفريغ الهواء. وبعد اختفاء الفقاعات، أي بعد دقيقتين تقريباً، سنضعها داخل الفرن طوال الليل عند درجة حرارة 70 °C تقريباً، مما سيؤدي إلى تصلبها. النمط الذي أريدكم أن تنتبهوا إليه هو هذه الخزانات الثلاثة المختلفة لإنشاء تدرجات، بحيث يكون لدينا تركيز صفر في أحد الجانبين، وتركيز محدد في الجانب الآخر، ونتحرك بشكل موحد نحو ذلك، وسنقوم بعمل ثقب صغير في الطرف الآخر، والذي سيكون بمثابة المخرج في هذه الحالة.

تتمثل الخطوة التالية في قص أحد هذه النماذج ونقله إلى طبق بتري، مع جعل أسطح النموذج متجهة للأعلى. آمل أن تتمكنوا من رؤية المداخل الثلاثة والمخرج الواحد التي شرحتها لكم في هذه النماذج. سنستخدم ثقابات صغيرة للمداخل لكي نتمكن من استخدام أنابيب البولي إيثيلين، وسأستخدم ثقابات كبيرة للمخرج من أجل توفير خزان احتياطي.

سنبدأ بالمدخل الأول؛ حيث سأقوم بعمل ثقب، وسأفعل الشيء نفسه مع المدخل الثاني، بالإضافة إلى ثقب صغير آخر للمدخل الثالث. وتتمثل الخطوة الأخيرة في عمل ثقب كبير عند المخرج.

بمجرد الانتهاء، سيكون لدينا طبقة PDMS، وهي الطبقة العلوية، وسأستخدم طبقة زجاجية أخرى في الأسفل. وستكون هذه الشرائح المجهرية هي الطبقة السفلية في أجهزة الموائع الدقيقة. نحن الآن في غرفة التصنيع الدقيق، ولدي قطعة زجاج واحدة وطبقة PDMS واحدة، وأريد لصقهما معاً.

ما سنستخدمه الآن هو جهاز يسمى منظف البلازما (plasma cleaner). ما سيحدث داخل الغرفة هو أن البلازما تساعد في تفكيك الروابط السطحية الضعيفة واستبدالها بمجموعات كيميائية عالية التفاعل، كما سيتحول السطح في الواقع ليصبح محباً للماء (hydrophilic). ما سأفعله الآن هو أخذ قالب PDMS، والذي كان يمثل الطبقة العلوية ويحتوي على بعض القنوات بالداخل، وسأقوم بإزالة الشريط اللاصق الذي وضعته مسبقاً لمنع التصاق الغبار بالقالب.

سأقوم بوضعها داخل الغرفة. الخطوة التالية هي أن لدي طبقة زجاجية، وهي عبارة عن شريحة مجهرية، وستكون هذه هي الطبقة السفلية داخل الجهاز. لذا سأضع هذه الشريحة داخل الغرفة أيضاً.

ثم أغلق الغرفة بالكامل، وبمجرد إغلاقها، أقوم بتشغيل الطاقة أولاً ثم المضخة، وعلينا العودة إلى هذه الآلة بعد حوالي خمس دقائق من الآن. ما سأفعله هو إيقاف تشغيل الآلة؛ لذا أقوم بإيقاف تشغيل المضخة أولاً ثم الطاقة بعد ذلك، وأقوم بفتح الغرفة.

هذا الصوت ناتج في الواقع عن الضغط السلبي الذي تم تطبيقه خلال العملية داخل الغرفة. لذا سأقوم بإخراج الطبقات المختلفة وأريد دمجها معاً. وبما أن الزجاج يمثل الطبقة السفلية، سأمسكه بيدي اليسرى ليكون ثابتاً، ثم سآخذ طبقة PDMS وأضعها فوق طبقة الزجاج.

ولكن بما أن الأنماط موجهة للأعلى حالياً، سأقوم بقلب طبقة PDMS. سأضعها على الزجاج بعد ضغطهما معاً. يتم التصاقهما بسهولة تامة، وجزء من ميزة عملية المعالجة بالبلازما هذه هو قوة الالتصاق والديمومة.

هكذا يظهر الشكل في النهاية. لذا، مرة أخرى، هذه هي المداخل وهذا هو المخرج الخاص بي، ونحن مستعدون للانتقال إلى الخطوة التالية. يتم إجراء عملية تحضير الألياف داخل الجهاز، ثم يوضع في الحاضنة لمدة ساعة واحدة، وبعد ذلك نأخذ عينة من الحاضنة بعد مرور الساعة، ثم نضع وسط المزرعة السمكية ونقوم بتحضير المحلول.

لتحضير محلول EGF، قمنا بإضافة 15 nanogram من EGF و10 micromolar من 50 D إلى 2 mL من وسط الزرع، وذلك لتصور تدرج EGF عبر القناة. بعد ذلك، أخذنا 2 mL من وسط الزرع الافتراضي، وأضفنا 2 mL أخرى من وسط الزرع. هذان الموضعان يحتويان فقط على وسط زرع طبيعي لضخ وسط الزرع في الجهاز.

لذا أقوم بإزالة الفقاعة، ثم أعيد التوصيل، وهذه أيضاً فقاعة متحركة تهبط مرة أخرى. بعد ذلك، أستخدم 15 nanogram من EGF و 10 micromolar من fi dextra و 2 mil من الوسط الغذائي من العينة المأخوذة، وأضع السرنجة ثم أقوم بالتخلص من الفقاعة. وبعد ذلك، يتم تبديل المحلول، ثم العودة للمحلول السابق.

يتم سحب المحلول إلى حقنة غازية، ثم يتم الضغط على المكبس عدة مرات لإزالة الفقاعات؛ حيث يتم سحب جميع محاليل الحقنات أولاً، ثم يتم تحويل صمام التوزيع الثلاثي ليمر المحلول عبر الأنبوب حتى يخرج منه. وبعد خلط المحاليل وخروجها، يمكن إدخال الأنبوب في جهاز My Predict، ومن ثم تكون جميع المحاليل الثلاثة متساوية. يمكنك بعد ذلك توصيل مدخل قناة التسريب برفق.

وأخيرًا، هناك نوعان: الأول هو وسط استنبات عادي، والثاني هو وسط استنبات يحتوي على EGF ولتأكيد ملف تدرج EGF. هذه هي الخلايا في الشبكة، الخلايا في الشبكة.

سيكون هذا مخرج الخلايا، لذا سيتم إنشاء التدرج باستخدام القنوات الثلاث المركزية ومن ثم توليد التدرج داخل منطقة الخلايا. عادةً ما أقوم بعملية ترسيب الخلايا، حيث يتم وضع معلق الخلايا في المخرج، ثم يمكننا سحب السائل بلطف، وبذلك تتدفق الخلايا عبر منطقة الخلايا وتستقر تلقائياً على الطبقة المطلية، مع التأكد من انتشار الخلايا بشكل كامل. وبعد التأكد من انتشار الخلايا تماماً، يمكننا البدء في عملية الإ infusions ومن ثم دراسة هجرة الخلايا باستخدام جهاز توليد التدرج.