نظام لخلايا الظهارية التثقيف صبغات قزحية عدسة لدراسة التجديد في نيوت

الهدف العام من هذا الإجراء هو استزراع الخلايا الظهارية الصبغية للقزحية لدراسة تجديد العدسة في حيوان السلمندر. ويتم تحقيق ذلك من خلال تخدير السلمندر أولاً في محلول منوم، ثم استئصال العينين.

تتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في عزل الخلايا الظهارية الصبغية للقزحية من أنسجة العين، وذلك عن طريق إزالة أنسجة الشبكية أولاً، ثم قطع شظايا قزحية القرنية إلى نصفين ظهري وبطني. بعد ذلك، يتم فصل خلايا القزحية عن السداة ويتم استزراعها في المختبر لمدة أسبوعين. وبعد أسبوعين من التقليب، يتم تجميع خلايا IPE ثم زرعها في مستلم تم تحسينه.

بعد شهر من الالتئام، يكشف الفحص النسيجي عن إمكانية تجدد العدسة من خلايا الظهارة المباشرة (IPE) الظهرية والبطنية. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية في خطوات زراعة الخلايا والزرع، والتي يصعب تعلمها لأنها تتطلب مهارات دقيقة في التشريح المجهري والجراحات. ابدأ بتخدير سبعة من الفئران العارية على الأقل باستخدام 0.1%Ethel three amino benzoate methane sul acid، ثم استأصل عيونها جراحياً باستخدام الملاقط والمقصات الجراحية عن طريق قطع الجفن مع الملتحمة، ثم اقطع العصب البصري.

انقل العيون المُشرحة بسرعة إلى غطاء التدفق الصفحي وعقمها في إيثانول لوجو لمدة ثلاث ثوانٍ. ثم اغسل العيون مرتين في محلول هانكس الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم. انقلها إلى محلول هانكس جديد وتابع عملية التشريح.

باستخدام المشرط، اصنع شقاً في العين. ثم استخدم المقص للقص حول حافة القرنية. قم بإزالة العدسة وقص ما تبقى من أنسجة الشبكية مع الصلبة.

انقل معقدات القزحية والقرنية إلى طبق يحتوي على محلول hanks جديد باستخدام مشرط رقم 15. افصل المعقدات إلى نصفيها الظهري والبطني. يتم تحديد القزحيتين الظهرية والبطنية من خلال وجود بقع سوداء على الصلبة في الجانب الظهري، وقطع على شكل حرف V في القزحية البطنية.

افصل القزحية البطنية عن القزحية الظهرية. اجمع شظايا القزحية في طبق قطر 35 مليمتر يحتوي على 1 مليلتر من محلول L 15. احتفظ بالنصفين الظهري والبطني في أطباق منفصلة.

أضف الآن 150 µL من محلول dispa إلى الأطباق، واحضنها لمدة ساعتين عند درجة حرارة 27 °C. لجمع خلايا IPE من السدى، استخدم الملقط لتقشير خلايا IPE بلطف من جميع قطع الأنسجة التي تم جمعها.

بعد ذلك، انقلي خلايا IPE إلى أنبوب سعة 1.5 milliliter وقومي بالطرد المركزي بسرعة 1000 RPM لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة، ثم تخلصي من السائل الطافي. أعيدي تعليق الراسب في واحد milliliter من محلول Hanks، وكرري عملية الطرد المركزي لفصل الخلايا. تخلصي من محلول hanks وأعيدي تعليق الراسب.

في واحد ملليلتر من محلول التربسين بتركيز 1 إلى 250، يتم التحضين لمدة ساعتين عند 27 درجة Celsius، ثم تُطرد الخلايا مركزياً لغسلها وإزالة التربسين. يُضاف واحد ملليلتر من محلول L 15 ويُجرى الطرد المركزي مرة أخرى، ثم تُكرر عملية الغسل مرة إضافية ويُستبدل المحلول بـ 800 ميكرولتر من محلول L 15 الطازج، وتُنقل الخلايا بلطف باستخدام الماصة إلى المحلول. أخيراً، تُزرع الخلايا في أطباق ذات 24 بئراً مطلية بالكولاجين.

الإنتاج المعتاد من سبعة Ns هو أربع آبار من الخلايا الظهرية وأربع آبار من الخلايا البطنية. يتم تحضين الطبق لمدة أسبوعين عند 27 درجة مئوية بعد مرور أسبوعين. كما هو موضح هنا، يمكن نقل الجينات إلى IPE لفحص وظيفتها في تجديد العدسة.

تُظهر هذه المزرعة من خلايا ظهارة القزحية الصبغية (IPE) البطنية التي استمرت لمدة أسبوعين نفس المورفولوجيا التي تظهر في الخلايا الظهرية. لاحظ أن التصبغ يستمر حتى هذه المرحلة في كل من خلايا القزحية الظهرية والبطنية. قبل زراعة خلايا IPE، يجب تجميعها عن طريق إضافة 20 µL من صبغة dyse في 400 µL من وسط زراعة حديث إلى الخلايا، ثم تحريك الطبق بلطف وترك الخلايا طوال الليل في حاضنة عند 27 °C.

في اليوم التالي، استخدم السحب والضخ اللطيف بالماصة لفصل الخلايا ثم انقلها إلى أنابيب سعة 1.5 milliliter، الآن اغسل الخلايا عن طريق طرد الأنابيب مركزياً واستبدال السائل الطافي بـ one milliliter من L 15. كرر هذه الخطوة مرتين. استخدم 10 microliters من معلق الخلايا لحساب عدد الخلايا باستخدام الطرق القياسية.

بمجرد إتمام الحساب، قم بتجهيز من 3000 إلى 5,000 خلية في 200 µL من L 15 لكل تكتل. الآن، قم بطرد الخلايا مركزياً ثم حضنها لمدة 48 ساعة. عند درجة حرارة 27 °C، يمكن الآن زرع الخلايا في الحيوان المستقبل.

ابدأ بتخدير حيوان بالغ في محلول التخدير حتى يتوقف عن الحركة. استخدم الآن شفرة مشرط لإحداث شق في قرنية العين. بعد ذلك، قم بإزالة العدسة باستخدام الملقط.

بعد إزالة العدسة، ضع تجمع خلايا IPE أسفل نسيج القرنية مباشرة على الجانب البطني للعين. الآن، أعِد السلمندر إلى حاوية منفصلة واتركه ليشفى. خلال هذه الفترة، تعامل مع السلمندر بعناية لتجنب إتلاف النسيج الذي يتماثل للشفاء.

تتطلب الخلايا المزروعة شهراً كاملاً لتتجدد وتكون عدسة جديدة. بعد مرور شهر، يتم إزالة العيون الجديدة المزروعة بالخلايا المتجمعة وتثبيت النسيج. وباعتماد بروتوكول تجفيف قياسي، يمكن تضمين الأنسجة المثبتة في قوالب تضمين مناسبة لقطع مقاطع بسمك 15 ميكرومتر، ثم تقطيعها وصبغها بشكل مناسب.

بعد غرس التجمُّع في عين جديدة، يحفز التجمُّع المكون من خلايا الظهارة الصبغية للقزحية (IPE) الظهرية تكوين عدسة جديدة. كما لوحظ تحفيز عدسة المضيف من القزحية الظهرية في العين التي تحتوي على غرسة بطنية. ولا يُلاحظ أي تحفيز للعدسة من التجمُّع المُحضّر من خلايا IPE البطنية، ولكن عند الإفراط في التعبير عن جين six3 في وجود حمض الريتينويك، يُلاحظ تحفيز تكوين العدسة من التجمُّع البطني.

كذلك، يُلاحظ تحفيز تكوين عدسة مضيفة من القزحية الظهرية للعين بعد تطورها. وقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال تجديد العدسة لاستكشاف دور جينات مختلفة في سياق جديد.