إسقاط خلية بسيطة الشنق بروتوكول الثقافة للجيل 3D الأجسام الشبه الكروية

الهدف من هذه التجربة هو إنتاج بنيات ستيرويدية تشبه الأنسجة ثلاثية الأبعاد. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق حصاد الخلايا المستزرعة ثم تحضير معلق خلوي أحادي. بعد ذلك، يتم وضع قطرات من المعلق الخلوي على الجانب السفلي من الغطاء المقلوب لطبق زراعة الأنسجة.

بعد ذلك، يُقلب الغطاء فوق حجرة الترطيب. والخطوة الأخيرة هي تحضين القطرات المعلقة لمدة تتراوح بين 24 إلى 48 ساعة للسماح بتكوين التجمعات. يمكن بعد ذلك نقل هذه التجمعات إلى حمام مائي هزّاز وتحضينها لمدة تصل إلى خمسة أيام إضافية.

في النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر اختلافات في تماسك التجمعات أو فرز الخلايا من خلال مقايسات الانضغاط أو تماثل سطح النسيج أو مجهر الفلورسنت فوق البنفسجي (epi fluorescence microscopy). وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل الزرع النسيجي التقليدي ثنائي الأبعاد (2D) على سبيل المثال، في أن الخلايا النامية في بيئة ثلاثية الأبعاد (3D) تحاكي بشكل أوثق التفاعلات الخلوية التي تتعرض لها الخلايا في بيئة النسيج. وسأقوم بشرح هذه الطريقة لأبين لكم أنها بسيطة للغاية لدرجة أن الباحث الرئيسي (PI) يمكنه القيام بها.

لبدء هذه التجربة، قم بحصاد الخلايا الملتصقة عند وصول نسبة الاندماج إلى 90%. أولاً، قم بشفط وسط الزرع واغسل طبقة الخلايا مرتين باستخدام PBS. بعد ذلك، قم بشفط PBS وأضف باستخدام الماصة اثنين مللي لتر من محلول 0.05% trypsin-EDTA فوق الطبقة أحادية الخلايا.

ضع الطبق في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة Celsius واتركه حتى تنفصل الخلايا. بعد ذلك، أخرج الطبق من الحاضنة وأوقف عملية الإنزيمية بإضافة 2 mL من الوسط الغذائي الكامل.

استخدم ماصة سعة 5 mL لترشيح الخليط حتى يتم تعليق الخلايا بالكامل. بعد ذلك، انقل معلق الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 mL. أضف بواسطة الماصة 40 µL من محلول DNA بتركيز 10 mg/mL إلى معلق الخلايا، واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق بعد التحضين.

قم برجّ معلق الخلايا باستخدام جهاز vortex لفترة وجيزة، ثم قم بالطرد المركزي عند 200 ×g لمدة خمس دقائق. وبمجرد اكتمال عملية الطرد المركزي، قم بسحب الطافي S والتخلص منه، ثم أعد تعليق الراسب في 1 mL من الوسط الغذائي الكامل للغسل. كرر عملية الطرد المركزي وإعادة التعليق من الراسب في 1 mL من الوسط الغذائي الكامل.

بعد ذلك، قم بإجراء عد للخلايا باستخدام عداد خلايا آلي أو مقياس كرات الدم (hemo cytometer). قم بتعديل معلق الخلايا باستخدام الوسط الغذائي للوصول إلى تركيز نهائي قدره 2.5 × 10⁶ خلية/مليلتر. ثم انتقل إلى مرحلة تكوين القطرات المعلقة.

قم بتجهيز غرفة ترطيب عن طريق إزالة الغطاء من طبق زراعة أنسجة مقاس 60 مليمتر، ثم ضع 5 mL من PBS في قاع الطبق باستخدام الماصة. اقلب غطاء الطبق وضع حتى 2010 µL من قطرات معلق الخلايا على الجانب السفلي من الغطاء. تأكد من وضع القطرات بمسافات كافية بحيث لا تلامس بعضها البعض.

أعد وضع الغطاء الذي يحتوي على مستنبتات القطرات برفق فوق الطبق الذي يحتوي على PBS. ضع طبق الاستنبات في حاضنة زراعة الأنسجة. اضبط الحاضنة عند 37 °C، و5% ثاني أكسيد الكربون، و95% رطوبة، واتركها للحضن طوال الليل.

راقب القطرات يومياً وواصل التحضين حتى تتشكل إما رقائق خلوية أو تجمعات خلوية. وبمجرد تشكل الرقائق الخلوية أو التجمعات، انقلها إلى دوارق رج glass shaker flasks ذات قاع مستدير تحتوي على ثلاثة milliliters من الوسط الكامل. حضّن الدوارق التي تحتوي على الرقائق الخلوية أو التجمعات في حمام مائي رجّاج.

يتم الحفاظ على العينات عند درجة حرارة 37 °C و5% carbon dioxide لمدة 24 ساعة تقريبًا حتى يمكن رؤية تكوين الستيرويدات تحت مجهر تشريحي. وبمجرد تكوين الستيرويدات، يمكن قياس تأثير التدخلات التجريبية على تكوين الستيرويد وفقًا للإجراء الموضح في البروتوكول المكتوب. كما يمكن الآن رؤية تخلل الغشاء لأي صبغات فلورية تمت إضافتها مسبقاً باستخدام المجهر الفلوري.

توضح صورة المجهر ذات الحقل المضيء هذه تجمع خلايا MLL لسرطان البروستاتا لدى الجرذان بعد 18 ساعة من الحضن باستخدام طريقة القطرة المعلقة. وتظهر هذه الصورة تجمعاً ثانياً من خلايا MLL تشكّل بعد 18 ساعة من الزرع باستخدام طريقة القطرة المعلقة. تم زرع هذه الخلايا بوجود 25 micromolar من مثبط MEK المسمى PD 9 8 0 5 9، مما أدى إلى تكوين تجمع خلايا أكثر تماسكاً بشكل ملحوظ.

يوضح هذا الشكل الفرق في حجم التجمعات بين مستنبتات قطرة MLL المعلقة المعالجة بمثبط MEK، وحجم التجمعات في مجموعة الضبط غير المعالجة. تمثل النجمة فرقاً ذا دلالة إحصائية حيث P أقل من 0.0001. وبناءً على ما تم تحديده بواسطة اختبار t للطلاب بين التجمعات غير المعالجة وتلك المعالجة بمثبط MEK، يشير ذلك إلى أن المعالجة بمثبط MEK تؤدي إلى تكوين تجمعات أصغر حجماً وأكثر تماسكاً بشكل ملحوظ.

تم التقاط هذه الصورة باستخدام مجهر ستيريو Nikon Smz 800، وهي توضح جسماً كروياً تشكل نتيجة تحضين خلايا كبد جنين الدجاج في مستنبت القطرة المعلقة لمدة 18 ساعة، ثم في حمام مائي هزاز عند درجة حرارة 37 °C لمدة 48 ساعة. تُظهر هذه الصورة المجهرية البؤرية (confocal) سلوك الفرز الذي يحدث عند استزراع مجموعات خلوية معينة معاً باستخدام طريقة القطرة المعلقة؛ وقبل البدء في استزراع القطرة المعلقة، صُبغت خلايا كبد جنين الدجاج بصبغة pkh two المخصصة لطلاء الغشاء، وكذلك جنين الدجاج.

تم صبغ خلايا القلب باستخدام PKH 26. ثم خُلطت معلقات الخلايا ووضعت في قطرة معلقة. أُجريت الزراعة لمدة 18 ساعة، تلتها فترة حضانة لمدة 48 ساعة في حمام مائي هزاز عند 37 degrees Celsius.

يمكن ملاحظة المقطع الضوئي أن خلايا القلب الملونة باللون الأصفر محاطة بخلايا الكبد. تظهر هنا باللون الأزرق الكاذب سلالتان من خلايا L المنقولة التي تعبر عن NCA على أسطحها. وبنسبة 2.4 إلى 1، تم صبغها بصبغات الغشاء الفلورية المجمعة، PKH 2 و PK KH 26 المخلوطة بنسب متساوية، وزُرعت كقطرات معلقة كما سبق.

في هذا المثال، تظهر الخلايا التي تعبر عن مستويات عالية من cadian، والمصنفة باللون الأخضر، محاطة بتلك التي تعبر عن مستويات أقل من en cadian، والمصنفة باللون الأحمر. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إنجازها في 30 دقيقة أو أقل إذا نُفذت بشكل صحيح.