إسقاط خلية بسيطة الشنق بروتوكول الثقافة للجيل 3D الأجسام الشبه الكروية

الهدف من هذه التجربة هو توليد أنسجة ثلاثية الأبعاد مثل المنشطات. يتم تحقيق ذلك عن طريق حصاد الخلايا المستنبتة أولا ثم توليد معلق خلية واحدة. القطرات التالية من تعليق الخلية ، ترسيب على الجانب السفلي من الغطاء المقلوب من طبق زراعة الأنسجة.

ثم يتم قلب الغطاء على غرفة الترطيب. الخطوة الأخيرة هي احتضان القطرات المعلقة لمدة 24 إلى 48 ساعة للسماح بتكوين الركام. يمكن بعد ذلك نقلها إلى حمام مائي مهتز واحتضانها لمدة تصل إلى خمسة أيام أخرى.

في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر الاختلافات في التماسك الكلي أو فرز الخلايا من خلال مقايسات الضغط ، وتماثل سطح الأنسجة 10 أو الفحص المجهري الفلوري epi. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل زراعة الأنسجة التقليدية ثنائية الأبعاد ، على سبيل المثال ، هي أن الخلايا المزروعة في 3D تحاكي عن كثب التفاعلات الخلوية التي تمر بها الخلايا في بيئة الأنسجة. سأوضح هذه الطريقة لأوضح لك أنها بسيطة للغاية بحيث يمكن حتى للباحث الرئيسي القيام بذلك.

لبدء هذه التجربة ، قم بحصاد خلايا الالتصاق بنسبة 90٪ من الطلاقة. أولا ، قم بشفط وسائط الثقافة واشطف ورقة الخلية مرتين باستخدام PBS. ثم قم بشفط PBS والماصة ملليلترين من 0.05٪ في محلول EDTA على الطبقة أحادية الطبقة.

ضع اللوحة في حاضنة زراعة الأنسجة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية واحتضنها حتى تنفصل الخلايا. بعد ذلك ، قم بإزالة اللوحة من الحاضنة وإيقاف التحكم. إضافة ملليلترين من الوسط الكامل.

استخدم ماصة سعة خمسة ملليلتر لتقشير الخليط حتى تصبح الخلايا في حالة تعليق كامل. ثم انقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا. ماصة 40 ميكرولتر من 10 ملليغرام لكل مليلتر ، محلول الحمض النووي في معلق الخلية ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق بعد الحضانة.

دوامة تعليق الخلية لفترة وجيزة ثم جهاز الطرد المركزي عند 200 ضعف الجاذبية لمدة خمس دقائق. بمجرد اكتمال الطرد المركزي ، قم بشفط المادة الطافية S وتخلص منها ، ثم أعد تعليق اللوحة في مليلتر واحد من الوسط الكامل لغسلها. كرر الطرد المركزي وريس من الحبيبات في مليلتر واحد من الوسط الكامل.

بعد ذلك ، قم بإجراء تعداد الخلايا باستخدام عداد الخلايا الآلي أو مقياس الخلوي الدموي. اضبط تعليق الخلية باستخدام الوسائط على تركيز نهائي 2.5 في 10 إلى الخلايا الست لكل مليلتر. ثم انتقل إلى تشكيل قطرات معلقة.

قم بإعداد غرفة ترطيب عن طريق إزالة الغطاء من طبق زراعة الأنسجة بحجم 60 ملم وسحب خمسة ملليلتر من PBS في قاع الطبق. اقلب غطاء اللوحة والماصة حتى 2010 قطرات ميكرولتر من معلق الخلية على الجانب السفلي من الغطاء. تأكد من وضع القطرات متباعدة بشكل كاف حتى لا تلمسها.

استبدل الغطاء الذي يحتوي على مزارع القطرة برفق مرة أخرى في قاع الطبق الذي يحتوي على PBS. ضع لوحة الثقافة في حاضنة زراعة الأنسجة. تضبط على 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 95٪ رطوبة وتحتضن طوال الليل.

راقب القطرات يوميا واستمر في الحضانة حتى تتشكل صفائح الخلايا أو الركام. بمجرد تكوين صفائح الخلايا أو الركام ، انقلها إلى قوارير شاكر زجاجية مستديرة تحتوي على ثلاثة ملليلتر من الوسط الكامل. احتضان القوارير التي تحتوي على صفائح الخلايا أو الركام في حمام مائي مهتز.

يتم الحفاظ عليه عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة تقريبا حتى يمكن تصور تكوين الستيرويد تحت مجهر تشريح. بمجرد تشكيل المنشطات, يمكن قياس تأثير التلاعب التجريبي على تشكيل الستيرويد وفقا للإجراء المبين في البروتوكول المكتوب. أيضا ، يمكن الآن تصور الإقحام الغشائي لأي أصباغ فلورية مضمنة مسبقا باستخدام الفحص المجهري الفلوري.

توضح صورة المجهر الساطع هذه تجميع خلايا MLL لسرطان البروستاتا في الفئران بعد 18 ساعة من الحضانة باستخدام طريقة القطرة المعلقة. تظهر هذه الصورة مجموعة ثانية من خلايا MLL التي تشكلت بعد 18 ساعة من الثقافة باستخدام طريقة القطرة المعلقة. تمت زراعة هذه الخلايا في وجود 25 ميكرومولار من مثبط مجاهدي خلق PD 9 8 0 5 9 مما أدى إلى تراكم أكثر إحكاما من الخلايا.

هنا ، يتم توضيح الفرق بين مثبطات MEK المعالجة بثقافة القطرات المعلقة MLL والحجم الكلي وحجم الركام الضابط غير المعالج. تمثل العلامة النجمية فرقا ذا دلالة إحصائية في P أقل من 0.0001. كما حدده الطلاب اختبار T بين المجاميع المعالجة غير المعالجة ومثبطات مجاهدي خلق ويشير إلى أن العلاج بمثبطات مجاهدي خلق ينتج عنه مجاميع أصغر بكثير وأكثر إحكاما.

تم التقاط هذه الصورة باستخدام مجهر ستيريو Nikon Smz 800 وتوضح الستيرويد الذي يتكون من احتضان خلايا الكبد الجنينية للكتكوت في ثقافة قطرة معلقة لمدة 18 ساعة. ثم في حمام مائي يهتز 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. توضح صورة المجهر متحد البؤر هذه سلوك الفرز الذي يحدث عندما يتم استزراع مجموعات معينة من الخلايا باستخدام طريقة القطرة المعلقة قبل الشروع في تعليق خلايا الكبد الجنينية لزراعة الكتكوت المعلقة بصبغة طلاء بين غشاء PKH وجنين كتكوت.

تم تلطيخ خلايا القلب ب PKH 26. ثم تم خلط معلقات الخلية وتعليقها. تم إجراء الاستزراع لمدة 18 ساعة تليها 48 ساعة من الحضانة في حمام الماء المهتز 37 درجة مئوية.

يمكن ملاحظة من القسم البصري أن خلايا القلب الملونة باللون الأصفر محاطة بخلايا الكبد. اللون الزائف باللون الأزرق هنا ، اثنان من استنساخ الخلايا L و nardi المنقولة يعبرون عن NCA على أسطحهم. بنسبة 2.4 إلى واحد ، تم تلطيخها بالغشاء الفلوري في أصباغ مجمعة ، تم خلط PKH اثنين و PK KH 26 بنسب متساوية وزرعها كقطرات معلقة كما كان من قبل.

في هذا المثال ، يتم تغليف الخلايا التي تعبر عن الكاديان الراقية ، والتي تكون ذات لون أخضر زائف ، بتلك التي تعبر عن مستويات أقل من en cadian ، والتي تكون ذات لون أحمر زائف. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في 30 دقيقة أو أقل إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.