التسرع الضغط من الخلايا العصبية في الدماغ الرضية لدراسة الإصابات

الهدف العام من هذا الإجراء هو تطبيق ومراقبة الضغط النبضي على خلايا دماغية مستنبتة لدراسة إصابات الدماغ الرضحيّة. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تحفيز التمايز العصبي للخلايا المستنبتة باستخدام حمض الريتينويك. بعد ذلك، توضع الخلايا العصبية في جهاز ضغط الخلايا القائم على نظام ksky bar، حيث تتعرض لضغط نبضي بالمقدار والمدة الزمنية ذات الصلة بإصابات الدماغ الرضحيّة الناتجة عن الانفجارات.

وأخيراً، تخضع الخلايا لمقاييس البيولوجيا الجزيئية لتقييم تلف الخلايا والآليات المحتملة لإصابة الدماغ الرضية. وتظهر نتائج الفحص المجهري موت الخلايا العصبية وفقدان البنية المحورية للمحاور العصبية عند الضغط النبضي بقيمة 2 MPa ولمدة 0.7 ms. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل الارتطام المائي، في عدم وجود أقسام ذات ضغط سلبي وأن المدة الزمنية محكومة بدقة.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال إصابات الدماغ الرضحية TBI، مثل عتبة موت الخلايا العصبية أو إصابتها كدالة في الضغط النبضي، والمقدار، والمدة، وشكل التحميل. وعلى الرغم من أن مجموعتنا استخدمت هذه الطريقة حتى الآن لدراسة إصابات الدماغ الرضحية الناجمة عن الانفجار، إلا أنه يمكن استخدامها أيضًا لأنواع أخرى من إصابات الدماغ الرضحية مثل تلك الناجمة عن الارتطام. سيقوم بتوضيح الإجراء Matthew، وهو طالب دراسات عليا من مختبر البروفيسور Chen fang، و li ha، وهو فني من مختبري.

تستخدم هذه التجربة مجموعة قضبان Ksky تم إعدادها كجهاز لضغط الخلايا. يتكون الجهاز من قضيبين من سبائك الألومنيوم بطول ستة أمتار، معلقين بواسطة محامل نحاسية محاذية، بالإضافة إلى غرفة لضغط الخلايا في المختبر (in vitro). تتكون غرفة ضغط الخلايا، والموضوعة بين القضيبين، من أسطوانة مكبس.

يحتوي الأسطوانة على ثقب صغير مسنّن في قاعدة التجويف، والذي يعمل على تنفيس الهواء والسوائل الزائدة أثناء تثبيت عينة الخلايا. والمكبس مصنوع من نفس الأنبوب المستخدم في القضيب ومغلف بطبقتين أو ثلاث طبقات من شريط التفلون. أما الغطاء النهائي فيثبت شرائح الغطاء الزجاجية باستخدام مسمارين صغيرين من الفولاذ المقاوم للصدأ.

يستخدم هذا العرض التوضيحي خلايا SH SY five Y من الورم الأرومي العصبي البشري. ومع ذلك، فإن البروتوكول قابل للتطبيق على العديد من مزارع النماذج الخلوية. توضع الخلايا على شرائح زجاجية قطرها 18 مليمتر بكثافة 3000 خلية لكل square centimeter.

أثناء تحضين الخلايا في وسط DMEM المكمل، يتم تحفيز تمايزها عن طريق إضافة حمض الريتينويك بتركيز 10 micromolar إلى الوسط لمدة سبعة أيام، مع تغيير الوسط كل يومين. وفي اليوم السابع، تظهر الخلايا بنية محوريات عصبية متطورة وتصبح جاهزة لعملية الضغط. يتم تعقيم جميع أجزاء غرفة الضغط باستخدام جهاز التعقيم البخاري (autoclave)، وتُحفظ تحت الأشعة فوق البنفسجية أثناء تجميع الغرفة.

داخل غطاء الزرع، تأكد من أن برغي التهوية في الغرفة مثبت بشكل فضفاض في فتحة التهوية. عند قاعدة التجويف، املأ الغرفة بوسط نمو دافئ مُحضّر حديثاً. بعد ذلك، قم بتثبيت شريحة زجاجية مستزرعة الخلايا على غطاء المكبس بحيث تكون الخلايا متجهة للخارج، ثم أدخل المكبس بعناية في تجويف الغرفة.

قم بإزالة برغي التهوية، وأمل فتحة التهوية للأعلى، ثم ادفع المكبس إلى داخل الغرفة حتى يصل إلى خط مرجعي محدد مسبقاً. يترك هذا الإجراء عمق سائل يبلغ حوالي ستة مليمترات داخل غرفة ضغط الخلية. تجنب إدخال الفقاعات، وقم بتطهير برغي التهوية ثم أعد تركيبه لجعل الغرفة محكمة الإغلاق ضد الماء.

يجب ألا تسرب الغرفة تحت الحمل الساكن. قم بإعادة ضبط نظام قضيب Ksky. أعد الكتلة الثقيلة إلى موضعها الأصلي واستبدل مسمار القفل.

يولد مسمار القفل قوة تثبيت تمنع حركة قضيب السقوط حتى تنكسر المسامير. قم بتعشيق مسمار القفل الجديد باستخدام الرافعة الهيدروليكية حتى يصل الضغط إلى حوالي 200 PSI. استخدم الرافعة المقصية لضغط قسم التحميل المسبق في قضيب السقوط لضغط أعلى قليلاً من القيمة المطلوبة، ثم قم بإرجاعها للخلف لضمان تعشيق الاحتكاك الكامل لبرغي الرافعة. الآن، قم بضبط نظام الحصول على البيانات لأن عملية الضغط تستغرق حوالي millisecond واحدة.

اضبط تردد أخذ العينات على 1 ميجاهرتز باستخدام مقاييس انفعال بقيمة 2000 أوم في دائرة جسر ويتستون. يجب ضبط الجهد على 45 فولت عند القضيب الناقل. قم بتركيب غرفة الخلية بحيث يكون المكبس مواجهاً للقضيب الناقل.

ضع غرفة الخلية في كتلة على شكل V مدعومة بمرفاع مقصي مخبري صغير ومحاذية للشريطين. قم بتزييت كل سطح تلامس بشكل خفيف، وتخلص من أي هواء بين الأسطح المتلاصقة عن طريق فركها معاً برفق. الآن أصبح النظام جاهزاً.

قم بتفعيل نظام الحصول على البيانات وإجراء الاختبار عن طريق ضخ مشغل المشبك الهيدروليكي بسرعة. يؤدي هذا إلى كسر مسمار القفل، مما يتسبب في انفصال المشبك وانتقال موجة ضغط إلى الخلايا. بعد الاختبار، قم بإخراج الشريحة من الحجرة داخل غطاء زراعة الخلايا، ثم ابدأ في تقييم سلوك الخلايا.

مع اكتساب الخبرة، يمكن استخدام الجهاز لضغط نحو تسع شرائح زراعة خلوية في الساعة. وعند تحليل القراءة، قد تظهر أخطاء ناجمة عن فقاعات الهواء في بداية إشارة الشريط المرسل، ومع ذلك، لا تظهر هذه الأخطاء في هذا العرض التوضيحي.

إذا كان شريط النفاذية طويلاً بما يكفي، فيجب أن تبدأ أهم البيانات مع أول اضطراب وتنتهي حيث تُظهر القياسات ضغطاً سالباً؛ وتتناسب قراءة الجهد هذه مع الإجهاد الذي تتعرض له الخلايا من خلال تحليل مقياس الانفعال. قد تكون مدة النبضة المنقولة أقصر من مدة النبضة الساقطة. وإذا حُبست فقاعة صغيرة في السائل داخل غرفة ضغط الخلية، فقد لا تتجاوز قيمة النبضة المنقولة قيمة النبضة الساقطة، ولكن يجب أن يكون لها مرحلة استقرار (plateau) طويلة بما يكفي قبل عملية تفريغ الحمل.

وإلا، فإن هناك إما فقاعة هواء كبيرة محبوسة في الغرفة المختومة أو أن هناك عدم محاذاة بين وحدة التجميع والقضيب. بعد عملية الضغط، يمكن فحص الخلايا على الفور أو تحضينها لفترة أطول لفحصها لاحقاً. قارن الخلايا المضغوطة بالخلايا الضابطة في الغرفة التي عوملت بشكل متماثل ولكن لم تخضع للضغط، لتقييم التغيرات في طول neurite باستخدام المجهر الضوئي في نقاط زمنية مختلفة بعد التحضين.

يمكن استخدام صبغ التألق المناعي للأكتين لتقييم التغيرات في الهيكل الخلوي. كما يمكن استخدام الجسم المضاد للبروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة 2 (MAP two) لتصور التغيرات في أحد المؤشرات العصبية الرئيسية.

لتقييم تأثير الضغط النبضي على التعبير الجيني العصبي والاستماتي، يمكن استخدام تقنيات البيولوجيا الجزيئية القياسية مثل R-T-P-C-R إذا لزم الأمر. كما يمكن جمع كميات كافية من محللات الخلايا لإجراء لطخة مناعية من عدة عينات خلوية خضعت لنفس مستوى الضغط. في هذا المثال، نجح جهاز ksky bar في تطبيق ضغط نبضي من نوع النبضة الواحدة بمستوى 2 megapascal ولمدة تبلغ حوالي 0.7 millisecond على الخلايا العصبية المستنبتة كما يظهر في صور المجهر الضوئي؛ حيث أظهرت خلايا SHSY five Y العصبية البشرية التي تعرضت لضغط نبضي قدره 2 megapascal تكسيراً واضحاً في محاور الاستطالات العصبية مقارنة بخلايا التحكم التي لم تتعرض للضغط.

عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، يجب دائماً إمساك غرفة ضغط السوائل بهذا الشكل وليس بتلك الطريقة، لأن ذلك سيعرض الخلايا لضغط سلبي بعد تطويرها. لقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال العلوم العصبية لاستكشاف الآلية الخلوية لإصابات الدماغ الرضية تحت ظروف ضغط محكومة. ونحن نشكر الدعم التمويلي المقدم من مركز Army UNL لميكانيكا الصدمات.