والفحص ضوء بارد الكالسيوم عن التحليل الوظيفي من البعوض ( الزاعجة المصرية) والقراد ( مروحية الرأس المتثني) G - يقترن بروتين المستقبلات

الهدف العام من التجربة التالية هو تحليل علاقات البنية بالنشاط للببتيدات العصبية المفصليات المُصنّعة على مستقبلاتها المقترنة بالبروتين G (gpcr) المناظرة. ويتم تحقيق ذلك من خلال ترانسفكشن خلايا مبيض الهامستر الصيني (K one empty cells) بنواقل التعبير الخاصة بمستقبل G PCR R المطلوب للحصول على خطوط خلوية محولة مستقرة مشتقة من خلية واحدة، وفي الخطوة الثانية، يتم ترانسفكشن الخط الخلوي المستقر ببلازميد quaran، الذي يحمل جين التقرير Quaran لقياس التلألؤ البيولوجي داخل الخلايا في مقايسة لوحة التلألؤ البيولوجي للكالسيوم. بعد ذلك، يتم إجراء مقايسة لوحة التلألؤ البيولوجي للكالسيوم من أجل تحديد مستويات الكالسيوم السيتوبلازمي عند إضافة الليجاند الببتيدي إلى هذه الخلايا المؤشبة.

تم الحصول على نتائج تظهر اختلافات في وحدات التألق الحيوي عند تطبيق ببتيدات ذات بنى مختلفة أو تركيزات ببتيدية مختلفة على الخلايا المؤتلفة، بناءً على تحرر الكالسيوم داخل الخلايا الذي تم الكشف عنه بواسطة المراسل corrin في مقايسة الأطباق. وتكمن الميزة الرئيسية لاستخدام خطوط خلوية نسيلية محولة بشكل مستقر تعبر عن مستقبلات GPCRs مؤتلفة بدلاً من الاتجاهات وبروتوكولات التعبير في أن مستويات تعبير المستقبلات تكون أكثر تجانساً، مما يسمح بتحقيق الاتساق في النتائج. علاوة على ذلك، فإن استهداف بروتين aquarium إلى الميتوكوندريا يسمح بقياسات حساسة للكالسيوم من خلال التألق الحيوي؛ وسيقوم بتنفيذ تجربة اليوم طالبان في مرحلة الدراسات العليا، وهما lie وSimon Kersch، بالإضافة إلى باحث ما بعد الدكتوراه من مختبري.

لإنشاء خطوط خلوية مستقرة، ابدأ بزراعة خلايا مبيض الهامستر الصيني، K one الفارغة عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة تحتوي على 5% من ثاني أكسيد الكربون. حافظ على الخلايا الفارغة في وسط نمو يحتوي على 1x من المضادات الحيوية والمضادات الفطرية بعدما تنمو الخلايا بشكل صحي. ازرع خلايا مبيض الهامستر الصيني K one في دوارق زراعة الأنسجة T 25، واترك الخلايا تنمو طوال الليل في وسط نمو بدون مضادات حيوية حتى تصل درجة التلاقي إلى حوالي 30%.

قبل عملية عفن الترانسفكشن (transfection)، قم بتحضير ناقل تعبير DNA يحتوي على مستقبل GPCR المستهدف كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. اخلط الـ DNA مع 100 µL من وسط Optum reduced serum medium.

امزج 6 µL من كاشف التعدي الدهني (lipofection reagent) في 100 µL من وسط F 12 K الخالي من المصل، ثم حضّن المزيج في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح بين 30 إلى 45 دقيقة. بعد التحضين، امزج محاليل الحمض النووي (DNA) والمعدي الدهني (lipofection) بلطف عن طريق الإضافة تدريجياً على شكل قطرات. اترك المزيج في أنبوب سعة 15 mL في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح بين 10 إلى 15 دقيقة.

امزج خليط عفن ترانسفكشن بلطف في 1.8 milliliters من وسط F 12 K الطازج بإضافات قطرة بقطرة. بعد ذلك، اغسل الخلايا باستخدام PBS وأضف محلول الترانسفكشن الجديد هذا إلى الخلايا. يتبع ذلك حضن لمدة 18 hour.

قم بتغيير الوسط إلى وسط F 12 K مضاف إليه 10%FBS بدون مضادات حيوية، واتركه في الحاضنة طوال الليل حتى اليوم التالي. قم بتوزيع الخلايا على قارورتين من نوع T 25 باستخدام وسط F 12 K مضاف إليه 10%FBS بدون مضادات حيوية كما هو موضح في الإجراء المكتوب. يتم التحضين لمدة 18 ساعة إضافية.

استبدل الوسط الغذائي بوسط انتقائي. ثم قم بزراعة الخلايا باستخدام الوسط الانتقائي لمدة تتراوح من ثلاثة إلى أربعة أسابيع بمرور الوقت. سيؤدي ذلك إلى انتخاب الخلايا التي دمجت البلازميد بشكل مستقر في حمضها النووي الجينومي.

استمر في صيانة الخلايا باستخدام وسط الصيانة، وقم بتجميد الخطوط الخلوية بشكل دوري لمنع فقدانها في حالة حدوث تلوث غير متوقع. لاختيار الخطوط الخلوية النسلية، ابدأ بمعالجة الخلايا بالتربسين ثم قم بطردها مركزياً باستخدام وسط الصيانة كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. بعد ذلك، أعد تعليق الخلايا في 5 mL من وسط الصيانة.

قم بإزالة 0.5 milliliters من معلق الخلايا وأضف 4.5 milliliters من وسط صيانة جديد لعمل تخفيف بمقدار 10 x، ثم انقل 100 microliters من هذا التخفيف إلى 12 بئراً في لوحة ذات 96 بئراً لاختيار الخلايا المفردة. استمر في إجراء تخفيفات تسلسلية بمقدار 10 x لهذه الخلايا حوالي 19 مرة للوصول إلى معلق نهائي نظري يحتوي على خلية واحدة لكل 100 microliters، وانقل 100 microliters من كل تخفيف تسلسلي إلى 12 بئراً في لوحة ذات 96 بئراً. بعد حضنها لمدة 18 ساعة، افحص لوحات الـ 96 بئراً تحت مجهر ضوئي مقلوب أو مجهر فلوري، وحدد الآبار التي يبدو أنها تحتوي على خلية واحدة فقط أو خليتين انقسمتا بوضوح من خلية واحدة.

راقب الأطباق يومياً مع تغيير الوسط كل ثلاثة أيام. اترك الخلايا تنمو لمدة أسبوع واحد حتى تصل نسبة الالتحام إلى حوالي 80%. بعد ذلك، اشطف الآبار المحددة بـ 200 microliters من PBS والتريبسين.

تُغسل الخلايا بـ 100 µL من محلول PBS tripsin EDTA. يتم إزالة محلول PBS TRIPSIN EDTA، ثم يُضاف 100 µL من وسط الصيانة، وتُنقل الخلايا من كل بئر محددة إلى بئر واحدة في طبق سداسي الآبار يحتوي على 1 mL من وسط الصيانة.

بعد تنمية الخلايا في طبق سداسي الفجوات لمدة ثلاثة أيام، انقل الخلايا إلى دوارق T 25 منفردة. قم بتجميد الخط الخلوي بشكل دوري حتى يمكن استعادته في حال توقفت الخلايا عن إعطاء نتائج متسقة. ولتحديد الخط الخلوي الذي يظهر أعلى استجابة، اختبر الخلايا المنقولة باستخدام مقايسة التألق الحيوي للكالسيوم مع ربيطة نشطة مثل المستقبل، أو الببتيد، أو الربيطة، أو أي ناهض آخر يستخدم كعنصر تحكم إيجابي.

سيتم عرض مقايسة التألق الحيوي للكالسيوم بالتفصيل لاحقاً في هذا الفيديو. قم بإجراء اختيار الخلية المفردة للمرة الثانية قبل المضي قدماً في التجربة. عندما يتم اختيار الخطوط الخلوية النسلية للمقايسات والحفاظ عليها في المزرعة، فمن الضروري تتبع أرقام الممرات لأن الخلايا ذات أرقام الممرات العالية قد تتوقف عن الأداء في قارورة T 25.

تنمية الخطوط الخلوية التي تعبر عن المستقبل المطلوب في وسط الصيانة حتى تصل نسبة التلاقي إلى حوالي 90%. بعد معالجة الخلايا بالطريقة التريبتيكية وطردها مركزياً، يتم إعادة تعليقها في وسط الصيانة، ثم تخفيف الخلايا بمقدار 10 أضعاف تقريباً باستخدام وسط الصيانة، وحساب عدد الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer). بعد ذلك، يتم ضبط عدد الخلايا ليكون تقريباً 2 × 10⁵ خلية/مل، ثم يتم استزراع 2 مل من الخلايا في كل بئر من أطباق الزراعة ذات الستة آبار، وتحضين الطبق لمدة 24 ساعة، حيث يجب أن تصل نسبة تلاقي الخلايا إلى حوالي 60% قبل البدء في مقايسة لوحة التألق الحيوي للكالسيوم.

قم بتحضير الجين المراسل المطلوب في بناء ناقل التعبير. تم استخدام مراسل نصاب موجه للتعبير في الميتوكوندريا هنا. بعد ذلك، قم بنقل بلازميد هذا المراسل إلى الخلايا بتركيز 1 µg كما هو موضح في البروتوكول المكتوب.

بعد تحضين الخلايا في طبق سداسي الفجوات لمدة 24 ساعة، تُعامل بالتربسين ثم تُطرد مركزياً وتُعلق، ويُعد عدد الخلايا ليكون 400,000 خلية لكل ملليلتر، ثم يُنقل 100 µL إلى كل فجوة في طبق معايرة دقيقة أبيض رقيق القاع بـ 96 فجوة، وتُحضن لمدة 24 ساعة أخرى حتى يتم الوصول إلى درجة تلاقي تبلغ حوالي 80%. هذا هو التركيز الأمثل للخلايا لاختبار التلألؤ البيولوجي. يجب تنفيذ الخطوات التالية في الظلام، ولكن يتم عرضها هنا في الضوء.

لأغراض التوضيح، قم بتحضير كمية كافية من وسط DME الخالي من الكالسيوم والذي يحتوي على 5 µM من CHO terezin بمعدل 90 µL لكل بئر. قم بإزالة الأوساط القديمة من الطبق وأضف 90 µL في كل بئر. حضّن الأطباق لمدة ثلاث ساعات في الظلام عند 37 °C و5% CO2، وبعد ذلك تكون الخلايا جاهزة للاختبار.

يتم تنفيذ هذا العرض التوضيحي باستخدام قارئ الصفائح Nova star في وضع التلألؤ البيولوجي. لبدء عملية التطهير، يجب وضع مضخات الصفائح الخاصة بالجهاز في حامل الصفائح في الظلام. قم بإذابة الببتيدات في أنبوب EOR سعة 1.5 milliliter.

استخدم كمية كافية من وسط DME الخالي من الكالسيوم والوسط الغذائي لإضافة 10 µL من الببتيد بتركيز 10x لكل بئر. قم بتحديد عمق السحب وموضع تحديد محلول الببتيد قبل الاستخدام. قم بتحفيز الخلايا بإضافة 10 µL من الببتيد وابدأ فوراً في تسجيل انبعاث الضوء.

في هذا العرض التوضيحي، تم ضبط الجهاز لتسجيل الانبعاث الضوئي عند 465 نانومتر لكل بئر كل ثانيتين لمدة زمنية إجمالية قدرها 50 ثانية. بعد اكتمال التشغيل، اغسل مضخات الجهاز. كرر العملية لكل عينة ببتيد، واحفظ البيانات، ثم اغسل مضخات الجهاز مرة أخرى بعد انتهاء المقايسة.

يتم نقل بيانات انبعاث الضوء من كل بئر تلقائياً إلى ورقة بيانات Microsoft Excel بواسطة البرنامج البرمجي. انسخ البيانات من Excel إلى برنامج Prism Software 4.0. أنشئ رسماً بيانياً يوضح تركيزات الببتيد المختلفة على المحور x ووحدات التألق الحيوي.

في المحور Y، اختر تحليل ملاءمة منحنى الانحدار غير الخطي للحصول على منحنيات الاستجابة للتركيز لكل ببتيد وقيم EC 50 المقابلة لها. يجب تكرار كل تجربة ثلاث مرات لتحليل البيانات. وعند التعبير عنها في خلايا مبيض هامستر الصين، K one، تصرف مستقبل الكينين من بعوض Aedes aegypti كمستقبل متعدد الربيطات واستجاب وظيفياً لتركيز منخفض يصل إلى 1 nM.

بالنسبة للكينينات الثلاثة الداخلية لنوع eighties التي تم اختبارها بشكل فردي باستخدام مقايسة لوحة التألق الحيوي للكالسيوم. تم تحديد قيم EC 50 مختلفة إحصائياً بلغت حوالي 16 nanomolar لـ eighties aegypti kinine 3، و 26 nanomolar لـ eighties aegypti kinine two، و 49 nanomolar لـ eighties aegypti kinin one، مما أدى إلى ترتيب القوة بحيث كان eighties kinin three هو الأكثر قوة و eighties kinin one هو الأقل قوة كما هو موضح. إليكم مقارنة النشاط لستة نظائر من حمض alpha amino ISO butyric acid kinin على سلالة خلايا المبيض للهامستر الصيني K1 التي تعبر عن مستقبل كينين القراد عن طريق مقايسة لوحة التألق الحيوي للكالسيوم.

يمثل المحور Y نسبة وحدات التألق الحيوي القصوى لكل نظير، معبراً عنها كنسبة مئوية للتألق الحيوي الملحوظ عند تركيز معين مقابل الاستجابة القصوى الملحوظة عند جميع التراكيز المختبرة لكل نظير؛ حيث يُعد نظير KININE HEXA peptide F-F-F-S-W-G amide هو الضابط الموجب لنشاط المستقبل. وكان نظير kinine أحادي الاستبدال double F amino ISO butyric acid WG amide أكثر نشاطاً من الببتيد السداسي HEXA peptide KININE الذي استُخدم كضابط موجب، بينما كان نظير KININE الذي يحتوي على استبدالين بحمض الأمينوبوتيريك، aminobutyric acid FF aminobutyric acid WG amide، هو الأكثر فاعلية من بين نظائر الاستبدال المزدوج التي تم اختبارها. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية التعبير عن A-G-P-C-R والحصول على خطوط خلوية نسيلية لتحليل علاقات النشاط البنيوية للربيطات على المستقبلات عن طريق مقايسة التألق الحيوي للكالسيوم.