Name: عزل الكريات البيضاء في الدماغ التسلل (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: تعلم عزل الكريات البيضاء من دماغ الفئران المصابة بفيروس TMEV باستخدام الطرد المركزي التدرجي. تُمكّن هذه الطريقة الباحثين من دراسة استجابة المناعة الفطرية في الدماغ.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا العمل عن طريق منحة من NS64571 NINDS (CLH) ، عن طريق منح التطوير الوظيفي في وقت مبكر من مايو كلينيك (CLH) ، وبواسطة هبة سخية من دونالد وفرانسيس Herdrich (CLH) نود أن نشكر تدفق مايو كلينيك الأساسية الخلوي للحصول على المساعدة.

1. حقن الفيروس داخل القحف : تم تعديل هذه التقنية المستخدمة على نطاق واسع التالية والتي مختبرنا والزملاء. لفترة وجيزة ، والحقن داخل القحف من سلالة من التهاب الدماغ و النخاع دانيال فيروس تايلر الفئران (TMEV) أو صورية العدوى (1 ، 10) والتي أجريت على الفئران الشباب (يفضل 5-6 اسابيع من العمر) لانتزاع الكريات البيضاء في الدماغ التسلل (BILs). يرجى ملاحظة أن النتائج ستختلف بين سلالة دانيال ، من سلالة فول ، وسلالة GDVII. لغرض حصاد BILs والفئران تتلقى 2x10 5 من PFU TMEV والمصابين لمدة 24 ساعة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق الإبرة الحقن (27 قياس ، في ربع ، كندال) ، لتلقائي 1 مل حقنة هاملتون وتعيين لتسليم 10 ميكرولتر من الفيروس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع TMEV في 10 ميكرولتر DMEM في المحاقن مع الاهتمام الدقيق لفقاعات الهواء. عندما يكون ذلك مناسبا ، والفئران المصابة صورية على 10 ميكرولتر من DMEM خالية من الفيروسات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فقط قبل الحقن ، صب حوالي 1 مل من isoflurane في جرة الجرس الذي يحتوي على أسلاك الشبكة مع الركيزة القطن تحتها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الفئران direclty مكان على شبكة الأسلاك في جرة الجرس حتى تصبح تخدير طفيفة ، غير حساسة لقرصة أخمص قدميها ، وثبتوا من مخدر نشوق ، وحوالي 10-15 ثانية. وينبغي أن الفئران لا تأتي في اتصال مباشر مع isoflurane ، كمادة يمكن مزعجة والصودا الكاوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين تحت تأثير التخدير ، وإعداد للحقن الفئران عن طريق تحديد إحداثيات المناسبة بسرعة في منطقة القشرة الأمامية على الجمجمة باستخدام الحلاقة والتحبير. الموقع العام للحقن هو 1 ملم الأمامي لbregma 1 ملم والوحشي للخياطة السهمي على الجانب الأيمن (الشكل 1). في حين حقن المجسم قد تكون ملائمة لبعض الحالات التجريبية ، وجدنا أن حرة مباشرة من دون حقن الحلاقة أو التحبير هو مناسب للغالبية التجارب. فراق الفراء مع نقطة على طول الإبرة المحورين المناسب للحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإجراء الحقن ، وتوجيه عمودي الإبرة إلى الصحافة من خلال الجمجمة والعظام وبعمق حوالي 3 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أعرب عن الفيروس إلى الدماغ عن طريق الضغط على زر أسفل حقنة هاميلتون والانتظار 2 ثانية للفيروس بالدخول الى المخ قبل ان تنسحب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الإبرة بعناية ووضع الماوس في قفص ونظيفة وجافة. الفئران افاقته بسرعة واستئناف وظيفة عادية في غضون دقائق. قد يعطي الاهتمام المناسب على الفئران أن تظهر عليهم أعراض غير طبيعية ، مثل النزيف من موقع الحقن ، والقتل الرحيم للحيوان يكون مناسبا. يجب أن تتبع الحيوانات السليمة التعامل مع 6 والتمسك المعاهد الوطنية للصحة ورعاية الحيوان المؤسسية والمبادئ التوجيهية للجنة الاستخدام. </li></ol> 2. الدماغ التسلل الكريات البيض إعداد الخلية : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد الجولة القاع أنابيب الطرد المركزي التي يمكن أن أوك ريدج عقد قدرة 30 مل مع RPMI مل 10 1640 ، 9 Percoll مل و 1 مل PBS 10X ومواسير يجب الجلوس على مقاعد البدلاء RT على الدماغ أثناء عملية الإزالة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جلب Ficoll Paque - Plus لدرجة حرارة الغرفة (RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الحيوانية isoflurane تعديل جرعة زائدة (5) وإزالة بسرعة باستخدام أنسجة الدماغ الفولاذ المقاوم للصدأ ملعقة وضعها في أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على 5 مل RPMI على الجليد. في بعض الظروف ، قد يكون PBS - نضح المناسبة لإزالة الخلايا الدموية المحيطية تعميم من إعداد BILs. وينبغي أن يكون كاملا والفئران بشكل صحيح تخدير قبل PBS - الارواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الدماغ وRPMI حل ل7 مل زجاج بيركس طاحونة العلامة التجارية الأنسجة Tenbroeck والتجانس بلطف مع 10-15 السكتات الدماغية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الماصة إضافي 5 مل RPMI في الخالط والماصة صعودا وهبوطا مرتين. نقل جناسة الدماغ (حوالي 10 مل) إلى أنبوب الجولة القاع معدة مسبقا وعكس بلطف 2-3 مرات إلى مزيج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في الدماغ جناسة افي 7800g لمدة 30 دقيقة في الدوار RT في الزاوية الثابتة F0360 في جهاز للطرد المركزي بيكمان X - 22R أليجرا السريرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الطرد المركزي ، وإزالة الأنقاض التي الميلين طرحت في قمة الانحدار. جمع طبقة الكريات البيض التي تعوم فوق بيليه خلايا الدم الحمراء (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سلالة طبقة الكريات البيض من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومتر إلى 50 مل المخروطية. تحقيق حل ما يصل الى حجم 50 ملم مع RMPI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور الأنابيب التي تحتوي على المخفف تعليق خلية في جهاز للطرد المركزي في الدقيقة السريرية 1500 (600G افي) لمدة 5 دقائق على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح في وطاف جمع بيليه الخلية. Resuspend الكرية في مخزن FACS 1 مل (1 ٪ ألبومين المصل البقري ، أزيد الصوديوم 0.02 ٪ من الكالسيوم والمغنيسيوم PBS مجانا) ونقل إلى تعليق الخلية 5 مل الدور السفلي FACS الأنابيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق الأساس الذي تقوم عليه بعناية مع 1 زائد Ficoll - Paque مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في أنبوب دورة في الدقيقة 2500 (1400 قدم) في أجهزة الطرد المركزي لمدة 25 دقيقة السريرية على RT مع عدم وجود الفرامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأبيض ، رقيق في طبقة واجهة (الشكل 2) مع 1 مل ماصة ونقل إلى 5 أنبوب جديد FACS مل. غسل جells مع 4 العازلة FACS مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في أنبوب 1500 دورة في الدقيقة (600G افي) لمدة 5 دقائق على RT في أجهزة الطرد المركزي السريرية لخلايا بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف بيليه وجمع الخلية. Resuspend الكرية الكريات البيض في العازلة المناسبة والحفاظ على الجليد في أنبوب FACS جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عدد الخلايا ، وتقييم الجدوى الخلية الاستبعاد التريبان الأزرق وتحليلها حسب التدفق الخلوي. عموما ، يمكن أن نتوقع أن المحققين الحصول على ما يقرب من 5 × 10 5 خلية / الحيوانات. </li></ol> 3. immunophenotyping تدفق cytometric <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد عزل وعد كريات الدم البيضاء ، وتدور هذه الخلايا لمدة 3 دقائق في 1500 دورة في الدقيقة (600 قدم) في أجهزة الطرد المركزي السريرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الكرية في عرقلة العازلة التي تحتوي على ما يلي : FACS العازلة ، طاف من ورم هجين 2.4G2 (FC كتلة ؛ anti-CD16/32) ومصل بقري جنيني في نسبة 10:05:01 واحتضان لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد وإضافة أضداد ضد مستضدات مترافق خارج الخلية إلى الخلايا سدت في تركيز 1:200 واحتضان لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام. وصمة عار واحتضان خلايا في 200 ميكرولتر في صفيحة V - 96 - القاع أيضا. وتشمل الضوابط المناسبة وغير ملوثين عينات خلايا ملون تألقي التعويض ، حسب الاقتضاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في الخلايا الملون RT لمدة 3 دقائق في 1500 دورة في الدقيقة (600 قدم) في أجهزة الطرد المركزي السريرية باستخدام الدوار لمناسبة 96 - جيدا لوحات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح في وطاف غسل الخلايا مع 200 ميكرولتر FACS العازلة التي pipetting بلطف صعودا ونزولا 3 مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار الغسيل تقنية أعلاه مرتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الغسيل ، resuspend الخلايا في بارافورمالدهيد 2 ٪ ، ونقل إلى أنابيب FACS. مطلوب تثبيت لتحليل تدفق cytometric من الخلايا المصابة من الكواشف الأحيائية المستوى 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل الخلايا الثابتة على FACS Calibur دينار بعد تعديل طريقة تدفق الخلوي (8) وتحليل الملفات باستخدام FlowJo حاليا ، WinMDI أو غيرها من البرامج المتاحة التدفق الخلوي التحليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هو مطلوب عموما في تحليل الأحداث 50-100،000 لكل عينة لimmunophenotyping كافية. </li></ol> مترافق مباشرة الأجسام المضادة المستخدمة في هذه التجربة : تم الكشف عن CD45 مع استنساخ 30 - F11. تم الكشف عن Ly6C / G مع استنساخ GR1 ، RB6 - 8C5. تم الكشف عن CD11b مع استنساخ M1/70. تم الكشف عن F4/80 مع استنساخ BM8. 4. ممثل النتائج : نعرض النتائج phenotyping الخلية لBILs الماوس في 24 إصابة آخر ساعة (الشكل 3). والكريات البيض الملون ، مترافق مع PerCP الماوس مكافحة CD45 للكشف عن الخلايا المناعية ، PE - مترافق المضادة للماوس Ly6C / G للكشف عن التهابات حيدات ، APC - مترافق المضادة للفأرة وCD11b APC مترافق مكافحة الفأر F4/80 للكشف عن خلايا من سلالته الوحيدات. تم إجراء تحليل بأداة FACS Calibur دينار بحريني. <img src="/files/ftp_upload/2747/2747fig1.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"> الشكل 1. وتقع الترجمة التشريحية للموقع الحقن ، والحقن 1 ملم الأمامي لbregma 1 ملم والوحشي للخياطة السهمي على الجانب الأيمن. <img src="/files/ftp_upload/2747/2747fig2.jpg" alt="الشكل 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 2"> الشكل 2. يتم جمعها في البداية من التوضيح الفصل المتدرج من الكريات البيض وBILs. الكريات البيض مباشرة تحت طبقة المايلين والحطام فوق بيليه RBC في الانحدار Percoll. يتم جمع البيض ، طبقة رقيق (BILs) في واجهة من التدرج Ficoll. <img src="/files/ftp_upload/2747/2747fig3.jpg" alt="الشكل 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 3"> الشكل 3. وقد تم عزل نمط ظاهري مناعي من الدماغ infilatrating الكريات البيض في 24 ساعة بعد العدوى الكريات البيض الماوس. من الدماغ عن طريق الطرد المركزي كثافة الخليط من الفرق مستعدة الأنسجة من الحيوانات في 24 ساعة بعد العدوى داخل القحف. تم صبغ الخلايا مع أجسام مضادة ضد fluorescently - مترافق الماوس CD45 ، Ly6C / G ، CD11b وF4/80. تم تنفيذ تبوب الأولي بالتآمر CD45 ، وهي علامة للحصول على الخلايا المناعية ضد مبعثر إلى الأمام (FSC) ، وهو مؤشر على حجم الخلية (C). وقد تم تحليل ثم مرحبا CD45 (A ، D) ، CD45 الصغرى (B ، E) ، وNEG CD45 (F ، G) السكان لمستويات التعبير النسبية للعلامات الوحيدات والبلاعم Ly6C / G ، F4/80 (A ، B ، F) ، وCD11b (D ، E ، G). Ly6C / G + F4/80 + + CD11b عثر حيدات التهابات بشكل حصري تقريبا في عدد السكان مرحبا CD45 (A ، D) ، بما يتفق مع تسلل من هذه الخلايا من محيطها. في المقابل ، لو تم العثور على Ly6C/G-F4/80 CD11b + الضامة بشكل حصري تقريبا في لو CD45 (B ، E) وCD45 NEG (G) من السكان ، بما يتفق مع النمط الظاهري المقيم. في تجارب عديدة ، ونحن لم يلاحظ خلايا CD45 مرحبا أو Ly6C / G + F4/80 + + CD11b حيدات التهابات في الدماغ من غير مصاب أو صورية العدوى ،الفئران تيد (لا تظهر البيانات).

<ol><li>Buenz, E. J., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picornaviruses+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Picornaviruses and cell death.</a> Trends Microbiol. 14, 28-36 (2006).</li>
<li>Buenz, E. J., Limberg, P. J., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+3-parameter+flow+cytometry-based+cell+death+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A high-throughput 3-parameter flow cytometry-based cell death assay.</a> Cytometry A. 71, 170-173 (2007).</li>
<li>Deb, C., Lafrance-Corey, R. G., Zoecklein, L., Papke, L., Rodriguez, M., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demyelinated+axons+and+motor+function+are+protected+by+genetic+deletion+of+perforin+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropath.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Demyelinated axons and motor function are protected by genetic deletion of perforin in a mouse model of multiple sclerosis.</a> J. Neuropath. Exp. Neurol. 68, 1037-1048 (2009).</li>
<li>Deb, C., Howe, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKG2D+contributes+to+efficient+clearance+of+picornavirus+from+the+acutely+infected+murine+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">NKG2D contributes to efficient clearance of picornavirus from the acutely infected murine brain.</a> J. Neurovirol. 14, 261-266 (2008).</li>
<li>Donovan, J., &amp, P. B. rown, , P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Euthanasia%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Euthanasia.</a> Current Protocols in Neuroscience. , A.4H.1-A.4H.4 (2005).</li>
<li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Handling+%26+restraint%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Handling & restraint.</a> Current Protocols in Immunology. 73, 1.3.1-1.3.6 (2006).</li>
<li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parenteral+injections%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Parenteral injections.</a> Current Protocols in Neuroscience. , A.4F.1-A.4F.9 (2005).</li>
<li>Holmes, K. L., Otten, G., Yokoyama, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+analysis+using+Becton+Dickinson+FACS+Calibur%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry analysis using Becton Dickinson FACS Calibur.</a> Current Protocols in Immunology. , 5.4.1-5.4.22 (2002).</li>
<li>Howe, C. L., Ure, D., Adelson, J. D., LaFrance-Corey, R., Johnson, A., Rodriguez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T+cells+directed+against+a+viral+peptide+contribute+to+loss+of+motor+function+by+disrupting+axonal+transport+in+a+viral+model+of+fulminant+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">CD8+ T cells directed against a viral peptide contribute to loss of motor function by disrupting axonal transport in a viral model of fulminant demyelination.</a> J Neuroimmunol. 188, 13-21 (2007).</li>
<li>Lipton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theiler%27s+virus+infection+in+mice%3A+An+unusual+biphasic+disease+process+leading+to+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Theiler's virus infection in mice: An unusual biphasic disease process leading to demyelination.</a> Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

نستخدم التدفق الخلوي بشكل روتيني لتحديد كلا من نوعية الخلية إعداد الدماغ التسلل ، والتمييز مجموعات مختلفة من الخلايا المناعية 2 و 9. في نقطة زمنية حادة ، لدينا أسلوب BILs غلة نسب عالية من التهابات داخل حيدات السكان CD45hi فضلا عن النسب العالية من السكان في الضامة CD45lo. هذا يشير إلى أن بقوة استجابة مناعية استنساخه داخل الدماغ تتسم طريقتنا. هذه التقنية أهمية خاصة للتجارب التي تتطلب السكان جيدا تتميز ال...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> الكاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات </th></tr><tr><td> TMEV </td><td> هوي مختبر </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> دانيال سلالة </td><td> Invitrogen </td><td> 21063-029 </td><td></td></tr><tr><td> isoflurane </td><td> Novaplus </td><td> NDC 0409-3292-49 </td><td></td></tr><tr><td> جولة القاع أنابيب الطرد المركزي أوك ريدج </td><td> Nalgene </td><td> 3118-0030 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-093 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> جنرال إلكتريك للرعاية الصحية </td><td> 17-0891-02 </td><td></td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> روش </td><td> 11666789001 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll - Paque بلس </td><td> جنرال إلكتريك للرعاية الصحية </td><td> 17-1440-02 </td><td></td></tr><tr><td> التريبان الأزرق 0.4 ٪ (W / V) </td><td> Mediatech </td><td> 25-900 - CI </td><td></td></tr><tr><td> أنابيب مخروطية 15 مل </td><td> فالكون دينار بحريني </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 7 مل زجاج بيركس الأنسجة Tenbroeck العلامة التجارية طاحونة </td><td> الصياد </td><td> 08-414 - 10B </td><td></td></tr><tr><td> 40 ميكرومتر مصفاة الخلية </td><td> فالكون دينار بحريني </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> 50 مل المخروطية </td><td> فالكون دينار بحريني </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> ألبومين المصل البقري </td><td> سيغما </td><td> A9647 </td><td></td></tr><tr><td> أزيد الصوديوم </td><td> سيغما </td><td> S8032 </td><td></td></tr><tr><td> CMF - PBS </td><td> Mediatech </td><td> 21-040 - CV </td><td></td></tr><tr><td> FACS أنابيب </td><td> فالكون دينار بحريني </td><td> 352054 </td><td></td></tr><tr><td> مصل بقري جنيني </td><td> سيغما </td><td> F4135 </td><td></td></tr><tr><td> 2.4G2 ورم هجين </td><td> ATCC </td><td> HB - 197 </td><td></td></tr><tr><td> Costar V - أسفل لوحة </td><td> كورنينج </td><td> 3894 </td><td></td></tr><tr><td> أليجرا X - 22R أجهزة الطرد المركزي أو ما يعادلها </td><td> بيكمان </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> 96 لوحة وكذلك الدلو الدوار </td><td> بيكمان </td><td> S2096 </td><td></td></tr><tr><td> الزاوية الثابتة الدوار </td><td> بيكمان </td><td> F0360 </td><td></td></tr><tr><td> بارافورمالدهيد </td><td> سيغما </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> دينار بحريني FACS Calibur </td><td> العلوم البيولوجية دينار بحريني </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> FlowJo 7.5 </td><td> شجرة نجمة ، وشركة </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> CD45 </td><td> العلوم البيولوجية دينار بحريني </td><td> 557235 </td><td> استنساخ : 30 - F11 </td></tr><tr><td> GR1 (Ly6C / G) </td><td> العلوم البيولوجية دينار بحريني </td><td> 553128 </td><td> استنساخ : RB6 - 8C5 </td></tr><tr><td> CD11b </td><td> ebiosciences </td><td> 17-0112-83 </td><td> استنساخ : M1/70 </td></tr><tr><td> F4/80 </td><td> ebiosciences </td><td> 17-4801-82 </td><td> استنساخ : BM8 </td></tr></tbody></table>

عزل الكريات البيضاء في الدماغ التسلل

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

نحن تصف طريقة لإعداد الكريات البيضاء في الدماغ التسلل (BILs) من الفئران. نحن لشرح كيفية تصيب الدماغ و النخاع الفئران مع فيروس تايلر الفئران (TMEV) عبر تقنية الحقن داخل الجمجمة السريع ، وكيفية تنقية سكان الكريات البيض المخصب من الخلايا التسلل من الدماغ كله. باختصار ، هي تخدير الفئران مع isoflurane في غرفة مغلقة وخالية من ناحية حقن حقنة مع هاميلتون في القشرة الأمامية. ثم يتم قتل الفئران في أوقات مختلفة بعد العدوى عن طريق جرعة زائدة isoflurane والعقول كلها تستخرج والمتجانس في RPMI مع طاحونة Tenbroeck الأنسجة. وطرد الخليط الدماغ من خلال التدرج المستمر Percoll 30 ٪ لازالة الانقاض الخلية الميلين وغيرها. وتوترت ثم تعليق خلية في 40 ميكرون ، وغسلها وطرد على التدرج متقطع بلس Ficoll - Paque لتحديد وتنقية الكريات البيض. ثم يتم غسل الكريات البيض ومعلق في مخازن مناسبة لimmunophenotyping بواسطة التدفق الخلوي. التدفق الخلوي يكشف عن مجموعة من الخلايا المناعية الفطرية في المراحل المبكرة من العدوى في الفئران C57BL / 6. إصابة آخر في 24 ساعة ، مجموعات فرعية متعددة من الخلايا المناعية الموجودة في BILs ، مع السكان المخصب من GR1 + ، + CD11b وخلايا + F4/80. ولذلك ، فإن هذه الطريقة مفيدة في وصف رد الفعل المناعي للعدوى حادة في الدماغ.

ووصف طريقة سريعة للحصول على الكريات البيض التسلل من الدماغ الفئران. هذه الطريقة تستخدم الانحدار المستمر والمتقطع Percoll التدرج Ficoll لتحديد وتنقية طبقة الكريات البيض المخصب. ثم قد تكون معزولة الكريات البيضاء التي تتميز قياسات تدفق cytometric.

نصف في هذا البحث طريقة لتحضير الكريات البيضاء المرتشحة في الدماغ (BILs) من الفئران. ونوضح كيفية إصابة الفئران بفيروس تيلر للفئران...

الهدف العام من هذا الإجراء هو الحصول على مجموعة غنية بالكريات البيضاء من خلايا المناعة الفطرية من أدمغة الفئران المصابة إصابة حادة بفيروس التهاب الدماغ والنخاع (TMEV). ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق حقن الفئران بفيروس TMEV داخل القحف. بعد ذلك، يتم استئصال الدماغ وتجنيسه بلطف بعد مرور 24 ساعة من الإصابة.تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في استخدام تدرج كثافة مستمر من perca وغير مستمر من fol لتنقية طبقة الخلايا الغنية بالكريات البيضاء بشكل انتقائي. وفي النهاية، يمكن توصيف النمط الظاهري لمجموعة الكريات البيضاء المرتشحة في الدماغ والمشاركة في الاستجابة المناعية للعدوى الحادة في الدماغ عن طريق تحليل قياس التدفق الخلوي. مرحبًا، اسمي الدكتور تشارلز هاو.يمكن للطريقة التي سنقوم بشرحها اليوم أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال المناعة العصبية. على سبيل المثال، ما هي الخلايا المناعية التي تتسلل إلى الدماغ أثناء العدوى الحادة؟ ستقوم ريغان لا فرانس بشرح هذه الطريقة اليوم.قام كوري، وهو تقني أبحاث أقدم في مختبري، باستخلاص الكريات البيضاء المرتشحة إلى الدماغ. يتم تركيب إبرة قياس 27 في حقنة هاميلتون أوتوماتيكية سعة 1 مل، وضبط الحقنة على 10 µL. ثم يتم سحب 10 µL من وسط DMEM المصاب بـ 2 × 10⁵ PFU من سلالة Daniel لفيروس TMEV، أو 10 µL من وسط DMEM غير مصاب (sham infected) داخل الحقنة مع توخي الحذر الشديد لتجنب فقاعات الهواء.قم بتخدير فأر يتراوح عمره بين خمسة إلى ستة أسابيع وتحقق من التخدير عن طريق قرص إصبع القدم أثناء وجوده تحت تأثير التخدير. جهز الفأر للحقن من خلال تحديد الإحداثيات المناسبة بسرعة في منطقة القشرة الجبهية على جزء الجمجمة، ثم أبعد فرو الفأر مع توجيه سن الإبرة على طول كل من AE حسب ما يتطلبه الحقن، لجعل الحقن يوجه الإبرة بشكل عمودي على الجمجمة، واضغط بالإبرة عبر الغطاء العظمي إلى عمق تقريبي يبلغ 3 mm. ولحقن DMEM المصاب فيروسياً أو DMEM الوهمي في الدماغ، اضغط على زر حقنة Hamilton وانتظر لمدة ثانيتين حتى يدخل الوسط إلى الدماغ قبل سحب الإبرة.قم بإزالة الإبرة بعناية وضع الفأر في قفص نظيف وجاف. ستستيقظ الفئران من التخدير بسرعة وتستعيد وظائفها الطبيعية في غضون دقيقة واحدة، وذلك بعد 24 ساعة من العدوى الفيروسية أو العدوى الوهمية داخل القحف. وقبل عزل الكريات البيضاء المرتشحة في الدماغ، املأ أنبوب طرد مركزي Oakridge ذو قاع مستدير بـ 10 milliliters من RPMI 1649 و 10 milliliters من per call و 1 milliliter من 10 XPBS، ثم احفظ الأنبوب في درجة حرارة الغرفة.اترك عبوة FI call pack plus لتصل إلى درجة حرارة الغرفة، واملأ أنبوباً مخروطياً سعة 15 milliliter بخمسة milliliters من RPMI وضعه على الثلج في هذا الوقت أيضاً. بعد التضحية بالحيوان عن طريق جرعة زائدة من isof fluorine المعدلة، استخرج الدماغ بسرعة وضعه في الأنبوب المخروطى سعة 15 milliliter الذي يحتوي على الخمسة milliliters من RPMI، ثم انقل الدماغ ومحلول RPMI إلى مطحنة أنسجة زجاجية من ماركة Pyrex سعة 7 milliliter و 10 brook، وقم بتجنيس الدماغ بلطف من خلال 10 إلى 15 ضربة.بعد ذلك، اسحب خمسة ملليلترات إضافية من RPMI بالماصة وضعها في جهاز التجانس، ثم اسحب المحلول بالماصة للأعلى وللأسفل مرتين. انقل حوالي 10 ملليلترات من متجانس الدماغ إلى أنبوب طرد مركزي ذو قاع مستدير ومضلع تم تحضيره مسبقاً، واقلب الأنبوب برفق من مرتين إلى ثلاث مرات للمزج. الآن، قم بدوران متجانس الدماغ بسرعة 7,800 Gs لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة باستخدام جهاز طرد مركزي ذو دوار ثابت الزاوية.بعد عملية الطرد المركزي، قم بإزالة حطام الميالين الذي طفا على سطح التدرج. وتطفو طبقة الكريات البيضاء فوق راسب كريات الدم الحمراء. قم بترشيح طبقة الكريات البيضاء عبر مصفاة خلايا بقطر 40 micrometer في أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter.أكمل حجم المحلول حتى 50 milliliter. وباستخدام جهاز PMI، قم بطرد الأنبوب الذي يحتوي على معلق الخلايا المخفف في جهاز طرد مركزي سريري عند 600 Gs لمدة خمس دقائق. وفي درجة حرارة الغرفة، اسحب السائل الطافي واجمع كتلة الخلايا المترسبة.أعد تعليق الراسب في 1 mL من محلول fax المنظم، وأضف معلق الخلايا إلى أنبوب fax بقاع مستدير سعة 5 mL. أضف بعناية أسفل المعلقات 1 mL من محلول fi call pack plus في درجة حرارة الغرفة. قم بطرد أنابيب fax مركزياً عند 800 ×g في جهاز الطرد المركزي السريري لمدة 25 دقيقة.في درجة حرارة الغرفة ودون توقف، قم بإزالة الطبقة البيضاء الزغبية عند السطح الفاصل باستخدام ماصة سعة 1 mL وانقل هذه الطبقة إلى أنبوب fax جديد سعة 5 mL. اغسل الخلايا باستخدام 4 mL من محلول fax buffer. الآن، قم بتدوير الأنبوب مرة أخرى في جهاز الطرد المركزي السريري لترسيب الخلايا.بعد ذلك، يتم سحب السائل الطافي وجمع الراسب الخلوي. أعد تعليق راسب الكريات البيضاء في محلول الحجب، واحفظه على الثلج. ثم قم بعدّ الخلايا.بعد عزل وعدد كريات الدم البيضاء المتسللة إلى الدماغ، يتم توزيع الخلايا في طبق ذو قاع على شكل حرف V استعداداً للتنميط المناعي باستخدام قياس التدفق الخلوي. بعد ذلك، يتم تدوير الخلايا في جهاز طرد مركزي سريري.أعد تعليق الراسب في 200 µL من محلول الحجب (blocking buffer) واحضن الخلايا لمدة 30 دقيقة على الثلج. بعد ذلك، أضف الأجسام المضادة بتركيز 1:200، واحضن الخلايا لمدة 30 دقيقة أخرى على الثلج، مع مراعاة وضعها في الظلام هذه المرة. ثم قم بطرد الخلايا المصبوغة مركزياً باستخدام جهاز الطرد المركزي السريري، وبعد ذلك اسحب السائل الطافي.أضف 200 µL من محلول fax buffer إلى الراسب وقم بسحب السائل ودفعها بلطف باستخدام الماصة ثلاث مرات. بعد ذلك، اغسل الخلايا في جهاز الطرد المركزي مرتين إضافيتين بنفس الطريقة، وبعد الغسلة النهائية، أعد تعليق الخلايا في تركيز نهائي قدره 2% من para formaldehyde وانقل الخلايا المصبوغة إلى أنابيب fax. وأخيراً، اخضع الخلايا المثبتة لتحليل التدفق الخلوي (flow cytometry) وقم بتحليل الملفات دون اتصال باستخدام برنامج تحليل fax.تم عزل كريات الدم البيضاء من دماغ الفئران عن طريق الطرد المركزي بكثافة تفاضلية لمتجانسات نسيجية تم تحضيرها من حيوانات بعد 24 ساعة من العدوى داخل القحف. وكما يظهر في هذين المخططين النقطيين، وُجدت الخلايا الوحيدة الالتهابية الموجبة لكل من LY6CG و F4/80 و CD11b بشكل حصري تقريباً في مجموعة CD45 high، وهو ما يتوافق مع ارتشاح هذه الخلايا من المحيط. وفي المقابل، وُجدت البلاعم السالبة لـ LY6CG والمنخفضة لـ F4/80 والموجبة لـ CD11b بشكل حصري تقريباً في مجموعات CD45 low (اللوحتان اليساريتان) و CD45 negative (اللوحة في أقصى اليمين)، وهو ما يتوافق مع النمط الظاهري المقيم.بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير الكريات البيضاء من دماغ الحيوانات المصابة بشكل حاد.

isolation-of-brain-infiltrating-leukocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

نحن في هذا الفيديو لشرح كيفية عزل الخلايا وحيدة النواة من الجهاز العصبي المركزي من الدماغ و النخاع الذاتية مع الفئران المختبرية.

عزل خلايا وحيدات النوى من الجهاز العصبي المركزي مع الجرذان EAE

المقالة الحالية يصف بروتوكول السريع لعزل خلايا وحيدات النوى بكفاءة من أنسجة الحبل الشوكي والدماغ التي يمكن استخدامها بشكل فعال لتحليل تدفق cytometric.

عزل خلايا الدماغ والحبل الشوكي وحيدات النوى Percoll باستخدام التدرجات

في هذا الفيديو ، نقوم بعزل الخلايا أحادية النواة من دماغ الفأر باستخدام الطرد المركزي المتدرج للكثافة. يمكن استخدام تعليق الخلية أحادية النواة المعزول لمزيد من التحليل النهائي.

عزل الخلايا أحادية النواة عن دماغ الفأر: تقنية الطرد المركزي المتدرج للكثافة لعزل الخلايا أحادية النواة المقيمة في الدماغ

يوضح الفيديو عزل خلايا الدم المحيطية أحادية النواة المتسللة إلى الورم من دماغ الفأر باستخدام التفكك الميكانيكي والهضم الأنزيمي. يتبع ذلك الطرد المركزي المتدرج للكثافة لجمع الخلايا المناعية لمزيد من التحليل.

عزل الخلايا المناعية المتسللة للورم من دماغ الفئران

وهناك طريقة لعزل الكريات البيض التهابات الأوعية الدموية الملتصقة من الدماغ...

العزلة وتحليل الدماغ المعزول من الكريات البيضاء<em&gt; المتصورة berghei</em&gt; ANKA الفئران المصابة

الدماغ خلايا الدم النخاعي توصيف التالية السكتة الدماغية يمكن أن يؤديها التجسيم باستخدام طريقة المجزئ البصرية، أو عن طريق تحليل تدفق cytometric من الدماغ الكريات البيض تعليق. كلاهما تقنيات مفيدة لإجراء تمييز phenotypical دقيق لأهم مجموعات فرعية خلية الدم النخاعي وجدت في الدماغ الدماغية.

Stereological والتدفق الخلوي توصيف خلايا الدم البيضاء القطعان في نماذج من عابر أو الشلل الدائم نقص التروية

يلعب الالتهاب دورا مركزيا في التسبب في السكتة الدماغية الإقفارية. تشير الأدلة المتزايدة إلى أنه يعمل كسيف ذو حدين يؤدي إلى تفاقم إصابة الدماغ المبكرة ، ولكنه يساهم أيضا في الإصلاح لاحقا. يصف هذا البروتوكول عزل الخلايا المناعية عن الدماغ الإقفاري والتنميط الظاهري الخلوي للتدفق اللاحق.

العزلة وتحليل تدفق Cytometric من الخلايا المناعية من الدماغ الدماغية ماوس

المقدمة هنا هي طريقة واضحة لعزل وتدفق تحليل cytometric من الخلايا وحيدة النواة الدم المحيطي-التسلل الورم يمكن أن ينتج تعتمد على الوقت بيانات كمية عن وضع عدد وتنشيط الخلايا المناعية التي تدخل المبكر المكروية ورم في المخ.

العزلة وتحليل تدفق Cytometric من-التسلل الورم خلايا الدم المحيطي وحيدة النواة

تقدم هذه الورقة بروتوكولين محسنين لفحص الخلايا المناعية المقيمة والمشتقة من المحيط داخل الجهاز العصبي المركزي ، بما في ذلك الدماغ والحبل الشوكي والسحايا. يساعد كل من هذه البروتوكولات على التأكد من وظيفة وتكوين الخلايا التي تشغل هذه المقصورات في ظل حالة مستقرة وظروف التهابية.

عزل أنسجة الجهاز العصبي المركزي والسحايا المرتبطة به لتحليل المصب للخلايا المناعية

تستخدم هذه الدراسة قياس التدفق الخلوي واستراتيجيتين مختلفتين للبوابات على الضفائر الدماغية المعزولة المنتشرة في دماغ الفئران. يحدد هذا البروتوكول المجموعات الفرعية الرئيسية للخلايا المناعية التي تملأ بنية الدماغ هذه.

عزل وتوصيف الخلايا المناعية من الضفائر المشيمية للفئران المجهرية

للتحقيق في الاستجابة المناعية لاضطرابات الدماغ ، يتمثل أحد الأساليب الشائعة في تحليل التغيرات في الخلايا المناعية. هنا ، يتم توفير بروتوكولين بسيطين وفعالين لعزل الخلايا المناعية من أنسجة دماغ الفئران ونخاع عظم الجمجمة.

عزل الخلايا المناعية عن دماغ الفأر والجمجمة

تعلم عزل الكريات البيضاء من دماغ الفئران المصابة بفيروس TMEV باستخدام الطرد المركزي التدرجي. تُمكّن هذه الطريقة الباحثين من دراسة استجابة المناعة الفطرية في الدماغ.

عزل الكريات البيضاء في الدماغ التسلل

استكشف المزيد من الفيديوهات