وهناك طريقة بسيطة وفعالة لعزل تقوم البلاعم من الثقافات الابتدائية المختلطة من خلايا الكبد الكبار

الهدف العام من التجربة التالية هو الحصول على مزارع متعددة من البلاعم من الثقافات الأولية المختلطة لخلايا كبد الفئران دون الحاجة إلى معدات أو مهارات معقدة. يتم تحقيق ذلك أولا من خلال تفكك خلايا كبد الفئران البالغة عن طريق نضح الكولاجيناز ، يليه عزل جزء خلايا الخلايا الكبدية المتني. بعد ذلك ، يتم تحضين الخلايا في T 75 ، قوارير زراعة الأنسجة مع وسط النمو لإنشاء ثقافات أولية مختلطة لخلايا الكبد.

ثم بعد 10 إلى 12 يوما من الاستزراع ، يتم رج قوارير الاستزراع لتسهيل نقل البلاعم إلى الأطباق البلاستيكية التي يتم حصادها منها بعد التصاق انتقائي بعد فترة حضانة قصيرة. أخيرا ، يمكن حصاد أكثر من 10 من الخلايا الست بشكل متكرر من نفس قوارير زراعة الأنسجة T 75 على فترات يومين إلى ثلاثة أيام لأكثر من أسبوعين. تم وصف طرق عزل البلاعم الكبدية بشكل جيد.

ومع ذلك ، فإن معظم الطرق السابقة تتطلب معدات متطورة مثل رسام الطرد المركزي والمهارات التقنية المكررة. نقدم هنا طرقا بسيطة ومبتكرة للحصول على البلاعم الكبدية بعدد كاف ونقاء من الثقافات الأولية المختلطة لخلايا الكبد الملفوفة البالغة التي لا تتطلب معدات خاصة أو مهارات معملية متقدمة. سيتم عرض تشريح ونضح الكبد وتحضير الخلايا من قبل الأطباء نوركو وياماناكا وميكو يوشيوكا في المعهد الوطني لصحة.

ثم سيتم عرض عزل وتنقية البلاعم الكبدية من المخاطر الثقافية بواسطة الدكتور تاكيتو تاكينو في المعهد الوطني للعلوم البيولوجية الزراعية. لذلك دعونا نبدأ. للتحضير لوفرة كبد الفئران ، ابدأ بالتسخين المسبق لزجاجة واحدة من محلول الغسيل وزجاجة واحدة من محلول الكولاجيناز.

ثم بعد التأكد من التخدير عن طريق قرصة الجلد ، ضع فأرا ذكرا بالغا مخدرا في مقلاة من الفولاذ المقاوم للصدأ ورش 70٪ من الإيثانول على بطنه وصدره. بعد ذلك ، قم بعمل قطع صغير في منتصف البطن بمقص تشريح وقشر الجلد. ثم افتح البطن بالمقص وتأكد من موقع الوريد البابي.

بعد ذلك ، قم بتمرير الخيط الجراحي أسفل الوريد البابي وشد الخيط بشكل فضفاض. ثم قم بتثبيت الجزء البعيد من الفانوك الأجوف السفلي والوريد المساريقي بمشبك البعوض لمنع ارتجاع الدم إلى الكبد. افتح التجويف الصدري عن طريق قطع الحجاب الحاجز بالمقص وفضح القلب بعد عمل شق صغير في الوريد البابي بمقص العين ، وأدخل قسطرة بلاستيكية بحجم ملليمترين في الوريد وشد الخيط بإحكام حول القسطرة.

قم بتحميل نظام التروية بمحلول الغسيل الدافئ ثم قم بتوصيله بالقسطرة. ابدأ التروية في C اثنين بمعدل 10 ملليلتر في الدقيقة. في الوقت نفسه ، قم بعمل قطع في جدار الأذين الأيمن باستخدام مقص تشريح.

استمر في الوفرة لمدة 10 دقائق ، ثم قم بتبديل محلول الوفرة إلى محلول الكولاجيناز وقم بتقطيعه لمدة 10 إلى 20 دقيقة. بمعدل 10 مل في الدقيقة ، املأ دورق معقم ب 25 مل من محلول الكولاجيناز. ثم قم بإزالة الكبد المرفوح وضعه بحذر في الدورق

افرم الكبد إلى قطع صغيرة بالمقص. أضف 75 مل من MEM البارد إلى تعليق الخلية الناتج. بعد سحب العينة اللطيف ، قم بتصفية التعليق من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر.

لإزالة النسيج الضام في شظايا الأنسجة غير المهضومة ، اجمع المرشح في أنابيب مخروطية سعة 50 مل. انقل المرشح إلى أنابيب مخروطية سعة 50 مليلتر واغسل الخلايا أربع مرات عن طريق تدوير الخلايا أولا عند 50 جيجابايت لمدة دقيقة واحدة عند أربع درجات مئوية. مع الانفصال ، تخلص من المادة الطافية بعناية ثم أعد تعليق الحبيبات في MEM بارد وقم بتدوير الخلايا مرة أخرى بعد الغسيل الأخير.

إعادة تعليق خلايا الكبد في وسط النمو. الآن قم بزرع الخلايا في خمسة إلى 10 قوارير زراعة الأنسجة 75 طن بكثافة 6.7 في 10 إلى الخلايا الرابعة لكل سنتيمتر مربع. ضع قوارير الاستزراع في حاضنة واستبدل وسط النمو كل يومين إلى ثلاثة أيام.

بعد يوم واحد من الثقافة ، انتشرت خلايا الكبد المتني على سطح القارورة وتظهر مورفولوجيا نموذجية متعددة الأضلاع تشبه حصوات الكوب مع نواة أو نواتين مستديرتين. في غضون أيام قليلة من الثقافة ، تفقد خلايا الكبد المتني مورفولوجيا الخلايا الظهارية وتتحول إلى خلايا ليفية أكثر تسطيحا في اليوم السادس ، على النقيض من الطور ، تبدأ الخلايا الشبيهة بالبلاعم المستديرة الساطعة في التكاثر على صفيحة الخلايا الليفية. يصل نمو الخلايا الشبيهة بالبلاعم إلى المستويات القصوى في اليوم 12 تقريبا.

ينخفض عدد الخلايا الشبيهة بالبلاعم في اليوم 19 تقريبا عندما تبدأ صفيحة الخلايا الليفية في التدهور. وهكذا ، بعد حوالي سبعة إلى 10 أيام من الثقافة ، نقوم بتعليق البلاعم التي تكاثرت على ورقة الخلية في وسط المزرعة عن طريق الاهتزاز المتبادل لقوارير الثقافة لمدة 30 دقيقة بعد إعادة تعليق البلاعم. العب كل من الأطباق البلاستيكية غير المزروعة مقاس 100 ملم مع الوسط من قارورتين T 75.

أعد ملء قوارير الاستزراع بوسط النمو وأعدها إلى الحاضنة. احتضان الأطباق البلاستيكية لمدة 30 دقيقة بعد فترة الحضانة ، واغسل الأطباق ثلاث مرات عن طريق شفط الوسط وشطف الطبق البلاستيكي برفق باستخدام PBS كما هو موضح هنا في وقت مبكر يصل إلى 10 دقائق بعد طلاء البلاعم مثل الخلايا المرتبطة بسطح الطبق بينما تظل الخلايا الليفية الملوثة الأخرى معلقة. بعد شطف PBS ، يتم الحصول على مجموعة من البلاعم عالية النقاء.

كما هو موضح في هذا الشكل ، تكتسب الخلايا مورفولوجيا البلاعم النموذجية بعد 40 دقيقة من الثقافة وكثيرا ما يتم ملاحظة الخلايا الانقسامية كما هو موضح في الأسهم. لجمع هذه المجموعة الجديدة عالية النقاء من البلاعم في ملليلتر واحد من محلول رحلة LE Express إلى الخلايا المغسولة ووضع الأطباق مرة أخرى في الحاضنة لمدة 10 دقائق إضافية. بعد فترة الحضانة هذه ، أضف تسعة ملليلتر من وسط النمو ثم اكشط البلاعم المرفقة برفق باستخدام مكشطة الخلية وانقلها إلى جهاز طرد مركزي أنبوبي مخروطي سعة 15 مليلتر وتخلص من المادة الطافية.

أضف ملليلترا واحدا من وسط النمو ، وقم بفصل كتل الخلايا المعلقة إلى خلايا مفردة عن طريق سحب العينات القوية ، وتعداد عدد الخلية بواسطة مقياس الخلوي الدموي كما هو موضح في هذا الرسم البياني ، يمكن حصاد أكثر من 10 من الخلايا الست من قارورة ثقافة T 75 بشكل متكرر على فترات يومين إلى ثلاثة أيام لأكثر من أسبوعين ، مما يتيح إنتاجية إجمالية للخلية من 10 إلى سبعة لكل قارورة ثقافة T 75. كما هو موضح في هذه الصور ، فإن الخلايا المعزولة عبارة عن صبغة مناعية مع أجسام مضادة وحيدة النسيلة ضد مستضدات البلاعم للفئران مثل CD 68 أو ED one و CD 1 72 A أو OX 41. تمتلك هذه الخلايا خصائص وظيفية للضامة مثل البلعمة النشطة للميكروبيدات المسماة ب FITC.

في هذا الفيديو، قدمنا طريقة بسيطة وفعالة للحصول على البلاعم من المزارع الأولية المختلطة لخلايا الكبد الأحمر البالغة. لا يتطلب إجراءنا معدات أو مهارات معقدة ، ولكنه يوفر أعدادا كافية من البلاعم النقية التي يمكن حصادها بشكل متكرر من نفس ثقافة النحاس. يمكن تطبيق هذه الطريقة على أنواع الثدييات الأخرى.

شكرا لك على مشاهدة الفيديو ونتمنى لك التوفيق في تجاربك المستقبلية. الهتافات.