في التصوير المجراة من الحبل الشوكي عن طريق الماوس ثنائي الفوتون المجهري

الهدف من هذا الإجراء هو إجراء تصوير مستقر في الجسم الحي في الحبل الشوكي للفأر باستخدام منظارين مجهريين فوتونيين. يتم تحقيق ذلك عن طريق تخدير أولا بمزيج مخدر يحقق إيقاعا ثابتا وهادئا للتنفس. تتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في كشف العمود الفقري بالمستوى المطلوب ثم إجراء استئصال الصفيحة الفقرية لكشف الحبل الشوكي الأساسي بحيث يمكن تصويره في الجسم الحي.

الخطوة الثالثة هي وضع على جهاز تثبيت العمود الفقري. الخطوة الأخيرة هي عزل جزء الحبل الشوكي المكشوف. استعدادا للتصوير في الجسم الحي ، في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج توضح بالتفصيل السلوك الديناميكي للخلايا وتفاعلاتها مع أنواع الخلايا أو الهياكل الأخرى في الحبل الشوكي الحي من خلال التصوير بفاصل زمني في الجسم الحي باستخدام اثنين من المجهريات الفوتونية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالمحاولات السابقة لتصوير الحبل الشوكي في الجسم الحي هي أنها تولد بيانات تصوير الطريق في الجسم الحي التي لا تتطلب معالجة لاحقة ويمكن تقييمها على الفور واستخدامها لمزيد من التحليل. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى العلاج بعد إصابة أو مرض الحبل الشوكي لأنها ، على سبيل المثال ، تسمح لنا بدراسة تطور التنكس المحوري أو التجدد بعد ، على سبيل المثال ، إصابة في الوقت الفعلي إلى جانب إصابة الحبل الشوكي. يمكن استخدام هذه التقنية لدراسة تطور العمليات الالتهابية أو التنكسية العصبية في النماذج الحيوانية للأمراض ، مثل التصلب المتعدد أو التصلب الجانبي الضموري ، حيث يكون مرض الأمراض بارزا في النخاع الشوكي.

ابدأ الإجراء بوزن. بعد ذلك ، قم بتخدير عن طريق حقن مزيج التخدير داخل الصفاق. قم بإجراء قرص منتظم لإصبع القدم لضمان التخدير العميق للحيوان طوال التجربة واستكمل نصف الجرعة الأصلية من التخدير ، كل ساعة ، أو حسب الحاجة.

ثم ضع مرهم الدموع الاصطناعية على العينين لمنع جفاف القرنية وتلفها. قم بقص الشعر الموجود على ظهر بجهاز تشذيب وحلق الشعر المتبقي بشفرة حادة. بعد تطهير المنطقة المحلوقة ، ضع تحت المجهر وابدأ الإجراء بعمل شق طولي صغير حوالي 1.5 سم فوق مستوى العمود الفقري المطلوب.

كشف العضلات الخلفية عن طريق سحب النسيج الضام تحت الجلد بعناية. ثم افصل بعناية العضلات الفقرية عن العمود الفقري على المستوى المطلوب. قم بعمل أقل عدد ممكن من الشقوق لفصل العضلات عن جانبي كل عملية شائكية.

بعد ذلك ، اكشط العضلات المنفصلة بعيدا عن السطح الرقائقي. استخدم كاهي الأوعية الدموية الصغيرة للسيطرة على أي نزيف بسيط إذا لزم الأمر. استمر في كشط العضلات حتى تتعرض بشكل كاف للصفائح الأساسية ، ويمكنك تحديد العضلات التي ستزيلها بوضوح.

لإعداد مواقع دخول المشابك الشوكية على كل جانب من العمود الفقري ، أدخل أطراف زوج من المقصات المنحنية بين العضلات المجاورة للفقرات وقم بإزاحة الأنسجة العضلية بعناية لإنشاء أربعة جيوب حيث سيتم إدخال المشابك. ارفع العمود الفقري باستخدام ملقط طرف السن المستقيم للسماح بالإدخال الآمن لمقص الطرف الحاد المنحني أسفل الصفيحة دون لمس الحبل الشوكي. ثم قم بإجراء استئصال الصفيحة الفقرية عن طريق قطع العظم ببطء على جانب واحد ثم على الجانب الآخر ، استخدم قطعة قطن أو أدخل قطعة إسفنجية جيلاتين صغيرة قابلة للامتصاص برغوة هلامية مقطوعة مسبقا بجوار الشق للحد من النزيف الطفيف.

بعد ذلك ، استخدم السائل الشوكي الدماغي الاصطناعي المعقم المسخن مسبقا لغسل الأنسجة. تم تصميم جهاز تثبيت العمود الفقري خصيصا مع المكونات الرئيسية لمشابك الحبل الشوكي المعقدة Nagate STSA ، ومحول تثبيت رأس Nagate MA six N. تم تصنيع لوحة قاعدة من الفولاذ المقاوم للصدأ لتثبيت جزأين من الناجا في محاذاة بحيث يتم دعم رأس أثناء تثبيت العمود الفقري والذيل.

ضع في اعتبارك أن الجهاز بأكمله يجب أن يتناسب مع عدسة المجهر على مرحلة المجهر المنخفض لتثبيت. أولا ، ضعه على وسادة رفع على اللوحة الأساسية لجهاز تثبيت العمود الفقري. بعد تثبيت الرأس في محول تثبيت الرأس ، ضع المشبك الشوكي لجهاز SDSA على طول المحور الخلفي الأمامي للحيوان في الجيوب المعدة مسبقا ، محاطا باستئصال الصفيحة الفقرية.

ضع المشابك بزاوية حوالي 45 درجة بالنسبة للمحور الحبلي ROS للحيوان للسماح بمساحة كافية لخفض عدسة الغمر في الماء فوق الحبل الشوكي المكشوف. ثم ضع المشبك الثالث في قاعدة الذيل بحيث يمكن تعليق جسم بعد إزالة وسادة الارتفاع في تجربة التصوير. بعد ذلك ، قم ببناء بئر صغير من ختم الجل حول الحبل الشوكي المكشوف لتسهيل الحفاظ على الحبل الشوكي في السائل الدماغي النخاعي.

ثم قم بإزالة وسادة الارتفاع عندما تكون جاهزا لبدء التصوير في الجسم الحي ، أحضر جهاز التثبيت إلى غرفة المجهر المسخنة مسبقا وضعها على مرحلة المجهر المنخفض. تأكد من محاذاة استئصال الصفيحة الفقرية مع العدسة. اخفض عدسة الغمر في الماء بعناية في محلول السائل الدماغي النخاعي A ، وتأكد من أنها لا تلمس المشابك الشوكية أو ختم الجل.

استخدم مضان epi لتحديد مجال الاهتمام والتركيز عليه بعد ذلك. قم بالتبديل إلى وضع المسح بالليزر وقم بإجراء التصوير في الجسم الحي باستخدام مرشحات إثارة ليزر الفوتون والطول الموجي وثنائي اللون وتمرير النطاق للفلور الموجود في أنسجة الصورة. في نهاية تجارب التصوير ، قم بإزالة من جهاز تثبيت العمود الفقري.

امسح مانع تسرب الجل بعناية من المنطقة المحيطة باستئصال الصفيحة الفقرية ونظفه. قم بخياطة عضلات الظهر جيدا فوق استئصال الصفيحة الفقرية. ثم قم بخياطة شق الجلد ومسحه باستخدام البيتادين الموضح هنا كإسقاط لصور Zack كما كانت مطلوبة في الجسم الحي وتم إسقاطها لاحقا على طول المحور Z دون محاذاة الصورة.

الصورة خلايا دبقية موجبة GFP عالية الكثافة باللون الأخضر ، وبالقرب من الأوعية الدموية باللون الأحمر في النخاع الشوكي. فيما يلي صورة تكبير عالية لخلية دبقية صغيرة واحدة متصلة بجدار الأوعية الدموية تظهر بالتفصيل بعض عملياتها الممتدة حول الوعاء الدموي وبعضها باتجاه حمة الحبل الشوكي الموضحة فيما يلي مثال على التصوير المتكرر في الجسم الحي لنفس الأجزاء المحورية المسماة YFP حيث تم نقلها وتصويرها في الحبل الشوكي لنفس فأر خط YFPH في جلستين مختلفتين خمسة أيام. هذا مثال آخر على التصوير المتكرر الذي يظهر نفس الهياكل الوعائية والخلايا الدبقية الدقيقة التي تم تصويرها في الجسم الحي في الحبل الشوكي في يومين متتاليين.

فيما يلي تسلسل تمثيلي للفاصل الزمني تم الحصول عليه في الجسم الحي من الحبل الشوكي. يوضح هذا التسلسل بالتفصيل السلوك الديناميكي للعمليات الدقيقة للخلايا الدبقية الصغيرة باللون الأخضر وتفاعلاتها مع الأوعية الدموية باللون الأحمر. بمرور الوقت ، تم تصحيح الصور الأولية فقط لضوضاء الخلفية والسطوع والتباين ، وتم إنشاء فيلم الفاصل الزمني عن طريق رفض حزم الصور بالتتابع دون محاذاة الصورة.

بحساب متوسط الاختيار الأسترالي للطائرات الفردية ، تمر الأوعية الدموية عبر مجموعة مماثلة من طائرات Z مثل صور الخلايا الدبقية الصغيرة. عمق حجم الصورة 38 ميكرون. هذا تسلسل بفاصل زمني يوضح استقرار طريقة التصوير على مستوى مستوى Z واحد.

يوضح الاستحواذ السريع على نفس مستوى Z الفردي في الحبل الشوكي ل CX ثلاثة ، CR واحد فأر متغاير الزيجوت GFP المخدر بمزيج KXA ووضعه على جهاز تثبيت العمود الفقري الحد الأدنى من إزاحة الصورة بين الإطارات المتتالية. والجدير بالذكر أن معدل هذا التسلسل كان إطارا واحدا في الثانية ، وهو أسرع من معدل تنفس الماوس. من المحتمل أن يكون الإزاحة الطفيفة المتبقية ناتجة عن نبضات قلب.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحد من عدد الشقوق إلى الحد الأدنى ومحاولة الحد من أي نزيف طفيف بمجرد حدوثه. الآن بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء تصوير مستقر في الجسم الحي في سلك طاقة الماوس باستخدام منظارين مجهريين للصور.