بروتوكول لجمع ويلطخ Hemocytes من الحمى الصفراء البعوض الزاعجة المصرية

الهدف العام من هذا الإجراء هو جمع وصبغ الخلايا الدموية من البعوض. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق حقن حجم صغير من المخفف المضاد للتخثر في البعوض المبرد، وذلك لتحرير الخلايا الدموية وجعل جميع الخلايا الدموية في المحلول.

تتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في إزالة أرجل وأجنحة وطرف بطن البعوضة. وثالثاً، يتم حقن مخفف طازج في موقع منفصل من البعوضة لبدء عملية التروية. والخطوة الأخيرة هي توجيه اللمف الدموي المخفف نحو شريحة مُعدة مسبقاً بحيث يمكن تثبيت الخلايا الدموية التي تم جمعها وصبغها.

وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج توضح الأنواع الرئيسية وعدد المواقع الدموية الموجودة في أنواع البعوض المستهدفة من خلال المجهر الانزلاقي الأساسي. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل طريقة التدفق (profusion) في أنها تجمع بين بساطة طريقة التدفق والدقة المكتسبة من طرق الحقن العالية، ولكن بخطوات أقل للوصول إلى الهدف النهائي. هدفنا هو تحديد أنواع الخلايا الدموية ووفرتها استجابةً للتحديات المناعية.

تقوم بتوضيح هذه التقنية أمينة عبد الكم، وهي طالبة جامعية من مختبري. قبل البدء في البروتوكول، قم بتحضير محلول تخفيف اللمف الدموي في حصص قدرها 1 mL. تُخزن هذه الحصص عند درجة حرارة 20- °C، ويجب عدم إعادة تجميد أي جزء غير مستخدم من الحصة.

قم الآن برسم دوائر بقطر 1 سنتيمتر على شرائح مجهرية بسمك 1 مليمتر. تخصص شريحة واحدة لكل بعوضة. قم بتجهيز الإبر المسحوبة.

قم بكسر طرف كل إبرة مسحوبة لعمل فتحة للإبرة. قم بتركيب إبرة واحدة في حاملها المتصل بمكونات الأنابيب والمحقنة الخاصة بالحاقن الدقيق. بعد ذلك، قم بإزالة فقاعات الهواء من مجموعة الأنابيب وحامل الإبرة باستخدام زيت معدني.

قم بسحب الزيت المعدني في هذه الحقنة اليدوية وتأكد من عدم وجود أي فقاعات. ضع شيئاً تحت الإبرة لتجميع الزيت المتقطر. افتح هذا الجزء من الحاقن المجهري ثم ضع الزيت هنا للتخلص من أي فقاعات.

ويثبت هذا الجزء ببساطة في هذه الحقنة اليدوية تماماً كما فعلنا مع الطرف الآخر. قم بحقن الزيت المعدني ببطء بحيث يتدفق عبر الأنبوب البلاستيكي لإزالة أي فقاعات هواء عالقة. ومن ثم، قم بملء الجزء العلوي بالزيت المعدني مرة أخرى بكمية زائدة حتى يبدأ بالتنقيط.

وبعد ذلك، قم بتوصيل هذا الجزء مجدداً بالمحقنة الزجاجية لتجنب تكون أي فقاعات. ثم املأ المكونات المجمعة بالزيت المعدني حتى يمتلئ أنبوب الإبرة والمحقنة بالكامل. وبذلك يصبح المحقن الدقيق جاهزاً للاستخدام في توصيل المذيب.

بعد ذلك، يتم تحضير الحيوانات بالبدء بسحب 15 أنثى بالغة إلى حاوية قفص صغيرة وصلبة يتم غمرها بالكامل في الثلج. يتم تخدير البعوض عندما يتوقف عن الحركة بسبب البرودة، وهو ما يستغرق عادة ثماني دقائق أو أقل. توضع بعوضة واحدة مخدرة على شريحة ذات تجويف حيث ستتم عملية الحقن المجهري.

عند المجهر، اسحب 12 µL من مُخفف اللمف الدموي في المحقن الدقيق. ثبّت البعوضة برفق تحت المجهر باستخدام الملقط، ثم احقن من 3 إلى 3.5 µL من المُخفف. سينتفخ البطن بين القطعة البطنية السابعة والثامنة.

أثناء حقن المُخفف، يمكن حقن ثلاث بعوضات. وقبل إعادة تعبئة الحاقن الدقيق، توضع جميع البعوضات المحقونة في كوب بلاستيكي نظيف فوق الثلج حيث تتماثل البعوضات للشفاء لمدة خمس دقائق تقريبًا. وخلال فترة الحضانة، يعمل المُخفف المضاد للتخثر على إزاحة الخلايا الدموية الملتصقة بالأنسجة الداخلية.

بينما تتعافى الدفعة الأولى من الحيوانات أثناء فترة الحضنة، يمكن عادةً حقن ثلاث إلى خمس بعوضات أخرى. بعد مرور خمس دقائق بينما لا تزال البعوضات في الكوب، يتم تجهيز البعوض المحقون عن طريق قص أطرافها وأجنحتها وأطراف بطونها عند القطعة الثامنة باستخدام مقص دقيق. يجب توخي الحذر لعدم قص الأطراف والأجنحة بالقرب من الصدر أو الهيموليمف.

قد ينزلق الطرف. الآن، اغسل شريحة النقش في 70%ethanol وجففها باستخدام منديل kim wipe تحت المجهر. ضع بعوضة واحدة مشرحة عند الحافة الخارجية للدائرة المنقوشة.

املأ المِحَقن الدقيق بـ 12 µL من المُخفف الطازج. ثبّت البعوضة باستخدام الملقط واحِقن من 8 إلى 10 µL في الجانب الجانبي من الصدر الأوسط. احذر من حقن أي زيت معدني بعد عملية الحقن هذه.

سيتم جمع الدم اللمفاوي من البطن داخل الدائرة المحفورة، مع الضغط بلطف على البطن باستخدام الملاقط لتوجيه وتحفيز تدفق الدم اللمفاوي. اترك الآن الدم اللمفاوي المجموع ليجف على الشريحة، ومن المفترض أن تستغرق هذه العملية حوالي 10 دقائق.

تصبح الشرائح بعد ذلك جاهزة للتصبيغ. صبغ كل شريحة على حدة باستخدام Hema three. اغمس كل شريحة في المثبت خمس مرات لمدة ثانية واحدة فقط في كل غمسة.

اتبع ذلك بغمر الشريحة ثلاث مرات لمدة ثانية واحدة في المحلول الأول، ثم في المحلول الثاني. الآن، اشطف الجزء الخلفي من الشريحة فقط بالماء منزوع الأيونات، مع تجنب غسل الجزء الأمامي. جفف الجانب الأمامي وثبّت غطاء الشريحة باستخدام وسط التثبيت، ثم اضغط بلطف على غطاء الشريحة بحيث يملأ الوسط المساحة فوق النسيج المصبوغ بالكامل.

اترك الشريحة الآن لتجف لمدة ثلاث ساعات على الأقل للحصول على أفضل النتائج. يجب فحص وتصوير الخلايا الدموية المصبوغة في غضون أسبوعين من هذا التحضير. وقد تم تحديد هذه الخلايا المأخوذة من إناث بالغة باستخدام هذا البروتوكول.

تظهر الصورة الأولى موقعاً دمويًا أوليًا (pro hemo site) بناءً على شكله الفالسي ونسبة السيتوبلازم إلى النواة المنخفضة. وهذه الصورة لخلية ENO بناءً على شكلها الفالسي ونسبة السيتوبلازم إلى النواة. وأخيرًا، هذا موقع دموي من النوع الحبيبي (granulocyte type hemo site).

تتميز هذه الطريقة بنسيج أكثر حبيبية وشكل يشبه OID مقارنة بطرق الحقن العالية السابقة. وقد أعطى هذا البروتوكول عدداً إجمالياً مماثلاً من الـ he cytes، كما حدد المواقع الحبيبية كأكثر أنواع الخلايا شيوعاً على النحو نفسه. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون ساعة واحدة لحوالي 15 إلى 20 بعوضة إذا نُفذت بشكل صحيح.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية حقن البعوض بمادة dent بشكل صحيح، وكيفية جمع عينات الدم (hemos) منها، ثم كيفية تحضير عينات الدم للتصوير المرئي والمجهري.