في الوقت الحقيقي المعاوقة الكهربائية تقنية تستند إلى قياس غزو أحادي الطبقة الخلية البطانية من قبل خلايا السرطان

يوضح هذا الفيديو طريقة لمراقبة غزو الخلايا السرطانية أحادية الطبقة للخلايا البطانية باستخدام تقنية قائمة على المعاوقة الكهربائية في الوقت الفعلي. أولا ، توجد الخلايا البطانية للوريد السري البشري المشار إليها باسم VE في 16 بئر EPLs مطلية بأقطاب كهربائية ذهبية في قاع البئر. لتوليد خلايا سرطانية أحادية الطبقة ملتقية ، والتي ترتبط ب VE وتغزو الطبقة الأحادية HVAC التي تعطل تقاطعات الخلايا البطانية ، ثم يتم الحصول على قراءات المقاومة, التي تعتمد على المساحة الإجمالية لقاع البئر الذي تغطيه الخلايا.

يمكن بعد ذلك تحديد مدى الغزو بناء على التغيرات في المعاوقة الكهربائية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية أو الطرق الحالية ، مثل غرفة الفراغ ومقايسات METROGEL ، هي أن تفاعلات الخلايا السرطانية للخلايا البطانية تحاكي عن كثب العملية النقيلية في الجسم الحي ، ويتم الحصول على البيانات في الوقت الفعلي ويمكن قياسها بسهولة أكبر بدلا من تحليل نقطة النهاية للطرق الأخرى. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لغزو الخلايا السرطانية.

يمكن تطبيقه أيضا على أنظمة أخرى مثل التحقيق في تفاعلات الخلايا الخلوية في جهاز المناعة. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام المرحلة الأولى من التجربة حيث نلاحظ نمو خلايا UX لتقييم تكاثر الخلايا لأي خط خلوي دون مزيد من خطوات الغزو التي توضح الإجراء سيكون طالب دراسات عليا في موقع رحيم من مختبري. يجب تنفيذ جميع خطوات هذا البروتوكول في ظل ظروف معقمة في غطاء مزرعة الأنسجة.

يتم الاحتفاظ بنظام Xcel المستخدم في هذه التجربة بشكل دائم في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 37 درجة مئوية 5٪ ، وهي مخصصة فقط لهذه الأداة عند استخدامها الأول. يجب ترك الأداة في الحاضنة لمدة 16 ساعة على الأقل للتوازن مع بيئة درجة الحرارة والرطوبة الجديدة. بعد ذلك ، قم بإعداد من هناك EPL 16 عن طريق طلاءه ب 0.1٪ جيلاتين لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية.

بمجرد طلاء الطبق ، اغسله مرة واحدة باستخدام PBS. ثم أضف 100 ميكرولتر من المتوسط المعاد تكوينه لإجراء قراءة فارغة. لقياس مقاومة الخلفية في غياب الخلايا.

ضع EPL في نظام عامل Excel على الكمبيوتر. افتح برنامج وكيل Excel بالنقر فوق رمز برنامج RTCA على سطح المكتب في نافذة البرنامج. انقر فوق علامة تبويب التخطيط وحدد الآبار التي تحتوي على عينات.

لبرمجة وتيرة الحصول على البيانات في الوقت الفعلي. انقر فوق علامة تبويب الجدول الزمني ، ثم انقر فوق رمز إضافة خطوة يشير إلى عدد القراءات والفترات الزمنية التي تشير إلى الفاصل الزمني بين القراءات. يتم ضبطها تلقائيا على دقيقة واحدة و 1.00 دقيقة على التوالي.

هذا يبرمج النظام لإجراء قراءة الخلفية. انقر فوق إضافة خطوة وأدخل 300 في مربع المسح و 10 دقائق في مربع الفواصل الزمنية. سيؤدي ذلك إلى برمجة الجهاز لإجراء قياسات المعاوقة لمدة تصل إلى 50 ساعة.

لبدء التجربة ، انقر فوق أيقونة بدء خطوة. سيتم قياس مقاومة الخلفية لكل بئر بعد إجراء قياس الخلفية. تعرض النافذة الرسالة.

جاهز للخطوة التالية ، الرجاء النقر فوق. الخطوة التالية للبدء. في هذا الوقت ، يمكن إضافة الخلايا ويمكن مراقبة تكوين طبقة أحادية كما هو موضح.

في القسم التالي ، يتم زراعة الوريد السري البشري أو الخلايا البطانية أو VE المستخدمة هنا في EGM اثنين من الوسط المعاد تشكيلهما باستخدام مجموعة EGM ذات الرصاصتين اللتين تحتوي على مكملات عوامل النمو ، ويجب الحفاظ على 5٪ خلايا FBS في حاضنة 37 درجة مئوية في وجود 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في يوم التجربة ، تحقق من الطلاقة المشتركة ل HUB E تحت المجهر ، يجب أن تكون الخلايا ذات رقم مرور منخفض ، ويفضل ألا يزيد عن ستة وأقل من 75٪ Con بطلاقة لتوليد تدرج اللون ، أحادي الطبقة يحصد الخلايا بواسطة التربسين. بمجرد انفصال الخلايا عن القارورة ، يجب إزالة جميع آثار التربسين عن طريق الطرد المركزي عند 200 جم ، بعد الدوران ، اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS.

ثم أعد تعليق الخلايا وإعادة تشكيل e GM اثنين من الوسائط إلى تركيز 2.5 في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل مليلتر. بمجرد إعادة تعليق الخلايا ، قم بإزالة EPL المعايرة في الخلفية من نظام EXOGEN وأضف 100 ميكرولتر من تعليق HX إلى 100 ميكرولتر من E GM وسائطتين موجودتين بالفعل في اللوحة. ضع EPL على الفور في محلل خلية نظام Excel.

ابدأ في الحصول على قراءات المعاوقة بالنقر فوق زر خطوة البدء في نافذة البرنامج. اسمح للخلايا البطانية بالنمو. سيستمر النظام في أخذ قراءات المعاوقة كل 10 دقائق.

يظهر Uve تسطيحا عابرا مميزا لمؤشر الخلية بعد أربع إلى ست ساعات من البذر ، يليه استقرار آخر بعد 16 إلى 18 ساعة. وبالتالي ، من المهم ترك الخلايا تشكل طبقة أحادية التقاء لمدة 18 ساعة على الأقل. بمجرد تشكيل طبقة أحادية ، فقد حان الوقت لإضافة الخلايا الغازية استعدادا لمقايسة الغزو.

تحضير الخلايا السرطانية الغازية. هنا يتم استخدام خلايا الساركوما العظمية. ابدأ بحصاد الخلايا عن طريق التربسين.

قم بإزالة جميع آثار التربسين عن طريق تدوير الخلايا عند 200 جم وغسلها مرة واحدة باستخدام PPS. بعد غسل ريوس ، قم بتعليق الخلايا بينما تكون الكثافة النهائية واحدة في 10 إلى خمس خلايا لكل مليلتر في الوسط المستخدم لنمو الخلايا السرطانية مثل RPMI أو DMEA الوسط الذي يحتوي على 10٪ FBS. أوقف التجربة مؤقتا بالنقر فوق أيقونة خطوة الإيقاف المؤقت في نافذة البرنامج.

قم بإزالة EPL وشفط EGM اثنين من الطبقة الأحادية من الفراغ. أضف 100 ميكرولتر من معلق الخلايا السرطانية الذي يحتوي على واحد في 10 إلى الخلايا الرابعة. بشكل عام ، تعمل نسبة واحدة إلى 2.5 خلية سرطانية إلى الخلايا البطانية بشكل أفضل مع الفحص.

ومع ذلك ، يمكن تحسين النسبة لخطوط الخلايا الفردية. ضع EPL مرة أخرى في نظام عامل Excel في الحاضنة. انقر فوق خطوة المتابعة لمتابعة أخذ قراءات المعاوقة على فترات 10 دقائق.

راقب الغزو في الوقت الفعلي خلال الساعات الست إلى ال 12 القادمة. سينتج انخفاض مؤشر الخلايا عن تراجع الوصلات البطانية والاختراق عن طريق غزو الخلايا السرطانية. عند الانتهاء من التجربة ، استخدم برنامج التوليد لتطبيع النتائج إلى وقت إضافة الخلايا السرطانية الغازية.

يسمح برنامج الإخراج من النشاطات بالتطبيع إلى أي نقطة زمنية تم زراعة VEX على نظام التوليد كما هو موضح في هذا الفيديو ، وتمت إضافة خلايا K seven M أو خلايا K 12 بعد تكوين الطبقة الأحادية. كما هو موضح هنا ، يحدث انخفاض حاد في مؤشر الخلية في غضون ساعات قليلة من إدخال K seven M خليتين. K seven M two هو خط خلوي الساركوما العظمية النقيلي للغاية.

تعبر هذه الخلايا عن مستويات عالية من بروتين رابط الهيكل الخلوي ، والذي يفسر الخصائص الغازية لخط الخلية. من ناحية أخرى ، تكون خلايا K 12 أقل نقيلية وغير قادرة على اختراق الطبقة الأحادية البطانية بكفاءة مثل K seven M خليتين. ويتمثل هذا في انخفاض أقل عمقا في مؤشر الخلية كما هو موضح هنا.

يمثل عنصر التحكم الموضح هنا مقاومة الطبقة الأحادية uve. في حالة عدم وجود خلايا سرطانية ، أجريت التجارب في ثلاث نسخ. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس الغزو في الوقت الفعلي عن طريق إنشاء طبقة أحادية للخلية البطانية ، وتحدي الطبقة الأحادية بالخلايا السرطانية.

يمكن استخدام الخطوات الأولية للتجربة التي تنطوي على تكوين HU XL أحادي الطبقة لتقييم تكاثر الخلايا عن طريق المقاومة. اثنان.