في الوقت الحقيقي المعاوقة الكهربائية تقنية تستند إلى قياس غزو أحادي الطبقة الخلية البطانية من قبل خلايا السرطان

يوضح هذا الفيديو طريقة لمراقبة غزو الخلايا السرطانية لطبقة أحادية من الخلايا البطانية باستخدام تقنية تعتمد على المعاوقة الكهربائية في الوقت الفعلي. أولاً، يتم وضع الخلايا البطانية لوريد السرة البشري، المشار إليها باسم VE، في ألواح EPL مكونة من 16 بئراً ومطلية بأقطاب كهربائية ذهبية في قاع البئر. ولتكوين طبقة أحادية متلاصقة، تُضاف الخلايا السرطانية التي تلتصق بـ VE وتغزو طبقة HVAC الأحادية، مما يؤدي إلى تعطيل الوصلات بين الخلايا البطانية. بعد ذلك، يتم الحصول على قراءات المعاوقة، والتي تعتمد على المساحة الإجمالية لقاع البئر المغطاة بالخلايا.

يمكن بعد ذلك تحديد مدى الغزو بناءً على التغيرات في الممانعة الكهربائية. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل مقايسات الغرفة الفارغة (void chamber) ومقايسات METROGEL، في أن التفاعلات بين الخلايا البطانية والخلايا الورمية تحاكي عملية النقائل في الجسم الحي بشكل أوثق، كما يتم الحصول على البيانات في الوقت الفعلي وتكون قابلة للقياس الكمي بسهولة أكبر مقارنة بتحليل نقطة النهاية المستخدم في الطرق الأخرى. ومع ذلك، يمكن أن توفر هذه الطريقة رؤية معمقة حول غزو الخلايا السرطانية.

ويمكن تطبيق هذه الطريقة أيضاً على أنظمة أخرى، مثل دراسة التفاعلات بين الخلايا في الجهاز المناعي. علاوة على ذلك، يمكن استخدام المرحلة الأولية من التجربة، حيث نراقب نمو خلايا UX، لتقييم تكاثر أي خط خلوي دون الحاجة إلى خطوات غزو إضافية، وستقوم الطالبة في مرحلة الدراسات العليا رحيم من مختبري بتوضيح هذا الإجراء. يجب تنفيذ جميع خطوات هذا البروتوكول تحت ظروف معقمة داخل غطاء زراعة الأنسجة.

يُحفظ نظام Xcel المستخدم في هذه التجربة بشكل دائم في حضّانة بدرجة حرارة 37 °C و5% carbon dioxide، وتكون هذه الحضّانة مخصصة لهذا الجهاز فقط عند استخدامه لأول مرة. يجب ترك الجهاز في الحضّانة لمدة 16 ساعة على الأقل ليتكيف مع بيئة درجة الحرارة والرطوبة الجديدة. بعد ذلك، يتم تحضير Thence EPL 16 عن طريق طلاؤه بـ 0.1% gelatin لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 °C.

بمجرد طلاء اللوحة، اغسلها مرة واحدة باستخدام PBS. ثم أضف 100 µL من وسط e gm two المعاد تكوينه لإجراء قراءة فارغة، وذلك لقياس ممانعة الخلفية في غياب الخلايا.

ضع لوحة EPL في نظام وسيط Excel على الكمبيوتر. افتح برنامج وسيط Excel من خلال النقر على أيقونة برنامج RTCA الموجودة على سطح المكتب في نافذة البرامج. انقر فوق علامة تبويب التخطيط (layout) وحدد الآبار التي تحتوي على العينات.

لبرمجة تردد الحصول على البيانات في الوقت الفعلي، انقر فوق علامة تبويب الجدول الزمني (schedule)، ثم انقر فوق أيقونة إضافة خطوة (add a step). تشير عمليات المسح (sweeps) إلى عدد القراءات، بينما تشير الفواصل (intervals) إلى الفاصل الزمني بين القراءات. يتم ضبط هذه القيم تلقائياً على 1 و 1.00 minute على التوالي.

يقوم هذا الإجراء ببرمجة النظام لإجراء قراءة خلفية. انقر على "إضافة خطوة" وأدخل 300 في مربع المسحات (sweeps) و10 دقائق في مربع الفواصل الزمنية (intervals). سيؤدي ذلك إلى برمجة الجهاز لإجراء قياسات الممانعة لمدة تصل إلى 50 ساعة.

لبدء التجربة، انقر على أيقونة بدء الخطوة. سيتم قياس ممانعة الخلفية لكل بئر بعد إجراء قياس الخلفية. تعرض النافذة الرسالة.

للانتقال إلى الخطوة التالية، يرجى النقر. اضغط على الخطوة التالية للبدء. في هذه المرحلة، يمكن إضافة الخلايا ومراقبة تكوين طبقة أحادية كما هو موضح.

في القسم التالي، يتم استزراع خلايا الوريد السري البشري البطانية أو VE المستخدمة هنا في وسط EGM two المعاد تكوينه باستخدام مجموعة EGM two bullet kit التي تحتوي على مكملات عوامل النمو، و 5%FBS. يجب الحفاظ على الخلايا في حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في وجود 5%carbon dioxide. في يوم التجربة، تحقق من درجة تلاقي HUB E تحت المجهر؛ يجب أن تكون الخلايا ذات رقم ممر منخفض، ويفضل ألا يتجاوز ستة، وتكون أقل من 75%Con fluent. ولتوليد طبقة أحادية من hue، يتم حصاد الخلايا بواسطة trypsin. وبمجرد انفصال الخلايا عن الدورق، يجب إزالة جميع آثار trypsin عن طريق الطرد المركزي عند 200 G. وبعد عملية الدوران، تُغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS.

بعد ذلك، قم بإعادة تعليق الخلايا ووسط e GM two المُعاد تكوينه للوصول إلى تركيز 2.5 times 10 to the fifth cells per milliliter. وبمجرد إعادة تعليق الخلايا، قم بإزالة لوحة EPL المُعايرة للخلفية من نظام EXOGEN وأضف 100 µL من معلق HX إلى 100 µL من وسط E GM two الموجود مسبقاً في اللوحة. ضع لوحة EPL على الفور في محلل الخلايا الخاص بنظام Excel.

ابدأ في الحصول على قراءات الممانعة من خلال النقر على زر بدء الخطوة في نافذة البرنامج. اترك الخلايا البطانية لتنمو. سيستمر النظام في أخذ قراءات الممانعة كل 10 دقائق.

تُظهر خلايا Uve تسطحاً عابراً مميزاً في مؤشر الخلايا بعد أربع إلى ست ساعات من الاستزراع، يليه استقرار آخر بعد 16 إلى 18 ساعة. لذا، من المهم ترك الخلايا لتشكل طبقة أحادية متلاصقة لمدة 18 ساعة على الأقل. وبمجرد تشكل الطبقة الأحادية، يحين وقت إضافة الخلايا الغازية تحضيراً لمقايسة الغزو.

قم بتحضير الخلايا الورمية الغازية. في هذه التجربة، تُستخدم خلايا الساركوما العظمية (osteosarcoma). ابدأ بجمع الخلايا باستخدام التريبسين.

أزل جميع آثار التريبسين عن طريق تدوير الخلايا عند 200 G وغسلها مرة واحدة باستخدام PPS. بعد عملية الغسل، قم بتعليق الخلايا بكثافة نهائية تبلغ 1×10⁵ خلية/مل في الوسط المستخدم لتنمية الخلايا الورمية، مثل وسط RPMI أو DMEA الذي يحتوي على 10% FBS. أوقف التجربة مؤقتاً بالنقر فوق أيقونة إيقاف الخطوة في نافذة البرنامج.

قم بإزالة الـ EPL واشفط الوسط EGM two من الطبقة أحادية الخلايا VAC. أضف 100 µL من معلق الخلايا الورمية الذي يحتوي على 1×10⁴ خلية. وبشكل عام، فإن نسبة 1 إلى 2.5 من الخلايا الورمية إلى الخلايا البطانية هي الأفضل لهذا المقايسة.

ومع ذلك، يمكن تحسين هذه النسبة لكل سلالة خلوية على حدة. أعِد وضع الـ EPL في نظام جهاز Excel داخل الحاضنة. انقر على خطوة المتابعة للاستمرار في أخذ قراءات المعاوقة بفاصل زمني قدره 10 دقائق.

راقب عملية الغزو في الوقت الفعلي على مدار الساعات الست إلى 12 ساعة القادمة. سيؤدي تراجع الوصلات البطانية واختراق الخلايا الورمية الغازية إلى انخفاض في مؤشر الخلايا. عند الانتهاء من التجربة، استخدم برنامج exergen لتقييس النتائج بناءً على وقت إضافة الخلايا الورمية الغازية.

يسمح برنامج exergen بإجراء التسوية (normalization) لأي نقطة زمنية تم فيها استزراع خلايا VEX على نظام exergen كما هو موضح في هذا الفيديو، وقد تمت إضافة إما خلايا K seven M two أو خلايا K 12 بعد تكوين الطبقة أحادية الخلايا. وكما يظهر هنا، يحدث انخفاض حاد في مؤشر الخلايا (cell index) خلال ساعات قليلة من إدخال خلايا K seven M two. تُعد K seven M two سلالة خلايا لسرطان العظم (osteosarcoma) عالية الانتقال.

تعبر هذه الخلايا عن مستويات عالية من البروتين الرابط للهيكل الخلوي ene، وهو ما يفسر الخصائص الغازية لهذا الخط الخلوي. وفي المقابل، تُعد خلايا K 12 أقل قدرة على الانتقال وتفتقر للقدرة على اختراق الطبقة أحادية الخلايا البطانية بنفس كفاءة خلايا K seven M two. ويتمثل ذلك في انخفاض أقل عمقاً في مؤشر الخلايا كما هو موضح هنا.

تمثل عينة الضبط الموضحة هنا ممانعة الطبقة الأحادية للعنبية. وفي غياب الخلايا السرطانية، أُجريت التجارب في ثلاث مكررات. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية قياس الغزو في الوقت الفعلي عن طريق إنشاء طبقة أحادية من الخلايا البطانية، واختبار هذه الطبقة باستخدام الخلايا السرطانية.

يمكن استخدام الخطوات الأولية للتجربة التي تتضمن تكوين طبقة أحادية من HU XL لتقييم تكاثر الخلايا عن طريق الممانعة. اثنان.