Name: الجسيمات أسلوب التلصيق لتحديد فيروس شلل الأطفال (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: تعلم تقنية التلصيق الجسيمي لتحديد فيروس شلل الأطفال بسرعة باستخدام جسيمات الجيلاتين الحساسة. تُبسّط هذه الطريقة الفحص التقليدي وتُسرّع النتائج.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ونحن ممتنون لادا جونكو لمساعدتها التقنية الممتازة. ونحن ممتنون للبروفيسور أكيو Nomoto لتوفير تتكرم متجه التعبير عن الفيروسة العصوية PVR - IgG2a. وأيد هذه الدراسة في جزء من المنح التي تقدم للمساعدة في الترويج للقضاء على شلل الأطفال وبحوث الناشئة والمستجدة من الأمراض المعدية في وزارة الصحة والعمل والرعاية الاجتماعية.

1. إعداد المتوسطة الصيانة (MM) والنمو المتوسط ​​(GM) MM لإعداد وجنرال موتورز ، الرجاء راجع دليل مختبرات شلل الأطفال في منظمة الصحة العالمية 1. Dulbecco المتوسطة لتعديل النسر (DMEM) تستكمل مع 2 ٪ مصل العجل الجنين (FCS) و 10 ٪ يمكن استخدامها كبدائل للFCS MM وجنرال موتورز ، على التوالي. 2. إعداد المضادة للأضداد PV <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة المضادة للأجسام المضادة الكهروضوئية (الكهروضوئية RIVM كتابة ضدي) عن طريق إضافة المياه (0.5 مل في القارورة) إلى كل قارورة المضادة للأجسام المضادة الكهروضوئية (نوع 1 أو 2 أو 3). إضافة هذه الحلول تشكيل الأضداد (0.5 مل لكل منهما) إلى 4.5 مل من MM في أنابيب منفصلة المسمى. ملاحظة : يتم توفير بعض الكثير من الأجسام المضادة للPV كشكل المعاد (0.5 مل في القارورة). الكثير من هذا القبيل لمكافحة PV الأضداد ، بالإضافة إلى إعادة المياه ليست ضرورية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج متساو من حجم الأجسام المضادة لمكافحة PV المعاد. لمكافحة PV1 +2 ، 2 +3 ، أو 3 +1 : مزيج 1.8 مل من كل الأجسام المضادة المعاد (1.8 مل + 1.8 مل = 3.6 مل لكل الخليط). لمكافحة PV1 +2 +3 : مزيج 1.2 مل من كل الأجسام المضادة المعاد (1.2 مل + 1.2 مل + 1.2 = 3.6 مل مل). ملاحظة : يمكن أن تحتوي على عينات PV خليط من الأنماط المصلية مختلفة من الكهروضوئية. لتحديد النمط المصلي واحدة من الكهروضوئية في العينات مع مزيج من المحاضر الحرفية ، وحمامات المضادة للأضداد الكهروضوئية (أي 1 +2 ، 2 +3 ، 3 +1 ، 1 +2 +3) أمر ضروري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 05/01 حجم FCS (0.72 مل) لكل PV - المضادة (1 +2 ، 2 +3 ، 3 +1 ، أو 1 +2 +3) الأضداد (3.6 مل لكل منهما) (FCS النهائية 18.2 ٪). ملاحظة : إضافة FCS هو من أجل الحد من تراص غير محدد من الجسيمات الجيلاتين التي تسببها الأجسام المضادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الضد في برك -20 درجة مئوية حتى استخدامها في فحص للسلطة الفلسطينية. </li></ol> 3. إعادة تشكيل الجسيمات الجيلاتين توعيتهم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1.5 مل من العازلة إعادة إدراجها في مجموعة واحدة من الجسيمات فيال الجيلاتين توعية (على النحو المنصوص عليه مسحوق تجميد المجفف). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج جيد من خلال استغلال طيف </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الجسيمات المعاد توعية في 4 درجات مئوية. ويمكن تشكيل الجسيمات الجيلاتين تكون نشطة على الأقل 2 أسابيع يحتفظ بها في 4 درجات مئوية ، ولكن ينبغي أن نكون مستعدين تماما قبل الفحص. </li></ol> ملاحظة هامة : لا تخلط الكثير من جسيمات مختلفة الجيلاتين توعيتهم ، لأن الصورة غير تراص جزيئات الجيلاتين توعيتهم يمكن أن تكون مختلفة عن الكثير من الجسيمات. لكل تجربة ، يجب استخدام الكثير واحد من الجسيمات الجيلاتين توعيتهم. 4. السلطة الفلسطينية مقايسة لتحديد PV <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد لوحة المعايرة الدقيقة. لتحديد عينة الفيروس واحد ، نحن بحاجة إلى 5 آبار + واحد على الأقل السيطرة السلبية (الجسيمات دون وعي الفيروسات والأجسام المضادة ، كذلك # 6 في الأسفل ، وانظر أي السيطرة على الفيروس والأجسام المضادة في المثال). إجمالي عدد الآبار 5 × عينات + واحد على الأقل التحكم في مقايسة. ملاحظة هامة : يرجى اتخاذ واحد على الأقل لا تحكم الفيروسات والأجسام المضادة في مقايسة. قنينة واحدة من الجسيمات توعية تقريبا لتحديد عينات الفيروس 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 12 ميكرولتر / جيد المضادة للأجسام المضادة أو المعدلة وراثيا PV إلى لوحة المعايرة الدقيقة. الترتيب للوحة هو كما يلي (انظر أيضا مثال أدناه). في عينات من دون الضد (وأيضا # 1 و 6) ، وإضافة 12 ميكرولتر من جنرال موتورز بدلا من الأضداد المضادة للالكهروضوئية. ملاحظة هامة : إذا كان ينبغي اختبار العديد من عينات الكهروضوئية في هذا الاختبار ، فإن ماصة الأقنية أو الموزع يكون من المفيد لهذه الخطوة. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> كذلك # 1 </td><td> كذلك # 2 </td><td> كذلك # 3 </td><td> كذلك # 4 </td><td> كذلك # 5 </td><td> كذلك # 6 </td></tr><tr><td> جنرال موتورز </td><td> مكافحة P1 +2 +3 </td><td> مكافحة P1 +2 </td><td> مكافحة - P2 +3 </td><td> العاني - P1 +3 </td><td> جنرال موتورز </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 12 ميكرولتر / بئر عينة الفيروس. في عينة واحدة من دون فيروس (جيد # 6) ، وإضافة 12 ميكرولتر من جنرال موتورز بدلا من حل الفيروس. ملاحظة : عينة الفيروس هو طاف ثقافة الخلايا المصابة والخلايا أو الخلايا عادة L20B RD. ملاحظة هامة : إذا كان ينبغي اختبار العديد من عينات الكهروضوئية في هذا الاختبار ، سيكون من المفيد ماصة الأقنية لهذه الخطوة. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> كذلك # 1 </td><td> كذلك # 2 </td><td> كذلك # 3 </td><td> كذلك # 4 </td><td> كذلك # 5 </td><td> كذلك # 6 </td></tr><tr><td> عينة الفيروس </td><td> عينة الفيروس </td><td> عينة الفيروس </td><td> عينة الفيروس </td><td> عينة الفيروس </td><td> جنرال موتورز </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ المعاد حل الجسيمات بحساسية من 4 درجات مئوية إلى درجة حرارة الغرفة ، والاستفادة تماما برفق لتعليق الجسيمات. ملاحظة هامة : بعد الوقف الكامل للجسيمات من خلال استغلال طيف ، ينبغي أن تضاف الجزيئات على الفور إلى لوحات قبل precipita والجسيمات العالقةالشركة المصرية للاتصالات وشكل غير متجانسة الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 25 ميكرولتر / جيدا الجسيمات توعية جميع الآبار. ملاحظة هامة : بعد إضافة الجسيمات توعيتهم ، ينبغي على الفور لوحة يتعرضون لوحة مزج لبدء رد فعل موحد للعينات. لذا ، ينبغي أن يؤديها إضافة الجسيمات توعيتهم باستخدام موزع لتصغير الفجوة الزمنية بين العينات في اللوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة المعايرة الدقيقة على خلاط واخلطه لوحة لوحة لمدة 30 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحة المعايرة الدقيقة على ورق أبيض (للراحة الملاحظة البصرية) على طاولة في درجة حرارة الغرفة (15 ~ 30 درجة مئوية) لمدة 2 ساعة. ملاحظة هامة : لا تتحرك لوحة أثناء وبعد رد الفعل لرصد النتائج وأخذ الصور. وشكلت تراص غير مستقر ومضطربا بسهولة عن طريق نقل الصفائح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط صور من لوحة. ملاحظة هامة : ويمكن رؤية جزئية من الصور لا تعطي معلومات كافية لفحص في وقت لاحق ، وإعادة النظر في نتائج للترجمة الشفوية. وينبغي اتخاذ عدة صور لتغطية جميع الآبار لوحات تركز على الصورة تراص من الآبار. </li></ol> 5. تفسير النتائج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الآبار الإيجابية والسلبية. مقارنة تراص في العينات مع عدم وجود مراقبة الفيروس والأجسام المضادة (ترسب جزيئات الجيلاتين ، وعدم تراص) (الشكل 1 و 2). يجب أن يحكم من تراص الصور التي يتم تمييزها بوضوح من أي فيروس وليس السيطرة الأضداد (غير تراص ، ومراقبة سلبية) بأنها إيجابية ، ويجب أن يحكم من تراص الصور التي تشبه إلى سيطرة السلبية والسلبية. ويمكن الحكم على العينات التي تظهر تراص واضحة ولكن جزئيا فقط بأنها إيجابية ، ولكن السجل ك "الإيجابية (تراص جزئي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الكهروضوئية. تفسير النتائج اعتمادا على الآبار الإيجابية والسلبية المضادة للأضداد الكهروضوئية لتحديد الأنماط المصلية الكهروضوئية. مبدأ تفسير النتيجة هي مماثلة لتلك التي في تحييد نظام اختبار ثقافة خلية (على سبيل المثال إيجابية لمكافحة الأجسام المضادة +2 P1 يشير إلى أن العينة تحتوي على نوع 3 PV). </li></ol> 6. ممثل النتائج ويظهر نتيجة ممثل السلطة الفلسطينية تحديد مقايسة الكهروضوئية في الشكل 1. جميع سلالات PV شكلت تراص جزيئات الجيلاتين توعيتهم (أي عينات الأضداد). في وجود أضداد PV المقابلة ، وترسب جزيئات الجيلاتين (غير تراص) مماثلة لفيروس لا توجد رقابة والأضداد (مراقبة سلبية) وحظ (على سبيل المثال ، PV1 (سابين) في حضور P1 مكافحة +2 أو P3 المضادة للأضداد +1). <img src="/files/ftp_upload/2824/2824fig1.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"> الشكل 1. حلول التعرف على الفيروسات التي PV مقايسة السلطة الفلسطينية. PV1 من (سابين) ، PV2 (سابين) ، وPV3 (سابين) (التتر الفيروس من 1.2 X CCID 8 10 50 / 12 ميكرولتر ، 8.2 × 10 7 CCID 50/12 ميكرولتر ، و واستخدمت 3.5 × 10 7 CCID 50/12 ميكرولتر ، على التوالي) لتحديد الهوية من جانب السلطة الفلسطينية مقايسة. لم يظهر أي فيروس وليس السيطرة الأضداد ترسب جزيئات الجيلاتين (غير تراص ، ومراقبة سلبية). <img src="/files/ftp_upload/2824/2824fig2.jpg" alt="الشكل 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 2"> الشكل 2. تفسير الآبار الإيجابية والسلبية. حلول الفيروسات من PV1 (سابين) ، PV2 (سابين) ، وPV3 (سابين) (التتر الفيروس من 2.4 × 10 8 ميكرولتر 50/25 CCID ، 1.7 × 10 8 CCID ميكرولتر 50/25 ، و وكانت مخففة 7.3 × 10 7 CCID 50/25 ميكرولتر ، على التوالي) 1 / 20-320 / 1 ، ومن ثم تم فحص عينات من 25 ميكرولتر المخففة التي مقايسة السلطة الفلسطينية من دون المضادة للPV الأضداد.

<ol><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Polio+Laboratory+Manual+%284th+edition%29+WHO%2FIVB%2F04.10%22">Polio Laboratory Manual (4th edition) WHO/IVB/04.10</a>. , 4th Edition, World Health Organization. (2004).</li>
<li>Arita, M., Masujima, S., Wakita, T., Shimizu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+particle+agglutination+method+with+soluble+virus+receptor+for+identification+of+poliovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of a particle agglutination method with soluble virus receptor for identification of poliovirus.</a> J. Clin. Microbiol. 48, 2698-2702 (2010).</li>
<li>Bibb, J. A., Witherell, G., Bernhardt, G., Wimmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+poliovirus+with+its+cell+surface+binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Interaction of poliovirus with its cell surface binding site.</a> Virology. 201, 107-115 (1994).</li>
<li>Koike, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+poliovirus+receptor+protein+is+produced+both+as+membrane-bound+and+secreted+forms%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J.+9%22%5BJournal%5D)">The poliovirus receptor protein is produced both as membrane-bound and secreted forms.</a> Embo J. 9. , 3217-3224 (1990).</li>
<li>Mendelsohn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+a+human+poliovirus+receptor+gene+into+mouse+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transformation of a human poliovirus receptor gene into mouse cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 83, 7845-7849 (1986).</li>
<li>Mendelsohn, C. L., Wimmer, E., Racaniello, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+receptor+for+poliovirus%3A+molecular+cloning%2C+nucleotide+sequence%2C+and+expression+of+a+new+member+of+the+immunoglobulin+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular receptor for poliovirus: molecular cloning, nucleotide sequence, and expression of a new member of the immunoglobulin superfamily.</a> Cell. 56, 855-865 (1989).</li>
<li>Arita, M., Koike, S., Aoki, J., Horie, H., Nomoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+poliovirus+with+its+purified+receptor+and+conformational+alteration+in+the+virion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Interaction of poliovirus with its purified receptor and conformational alteration in the virion.</a> J. Virol. 72, 3578-3586 (1998).</li>
<li>McDermott, B. M., Rux, A. H., Eisenberg, R. J., Cohen, G. H., Racaniello, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+binding+affinities+of+poliovirus+for+its+cellular+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Two distinct binding affinities of poliovirus for its cellular receptor.</a> J. Biol. Chem. 275, 23089-23096 (2000).</li>
<li>Pipkin, P. A., Wood, D. J., Racaniello, V. R., Minor, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+L+cells+expressing+the+human+poliovirus+receptor+for+the+specific+detection+of+polioviruses+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterisation of L cells expressing the human poliovirus receptor for the specific detection of polioviruses in vitro.</a> J. Virol. Methods. 41, 333-340 (1993).</li>
<li>Avoort, H. G. vander <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+five+methods+for+intratypic+differentiation+of+polioviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparative study of five methods for intratypic differentiation of polioviruses.</a> J. Clin. Microbiol. 33, 2562-2566 (1995).</li>
<li>Kilpatrick, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+group-%2C+serotype-%2C+and+vaccine+strain-specific+identification+of+poliovirus+isolates+by+real-time+reverse+transcription-PCR+using+degenerate+primers+and+probes+containing+deoxyinosine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid group-, serotype-, and vaccine strain-specific identification of poliovirus isolates by real-time reverse transcription-PCR using degenerate primers and probes containing deoxyinosine residues.</a> J. Clin. Microbiol. 47, 1939-1941 (2009).</li>
</ol>

Souji Masujima هو موظف من المنتجات الجديدة قسم التصميم ، شركة Fujirebio

في نقطة وحيدة من هذا الاختبار هو السلطة الفلسطينية الاستفادة من جزيء PVR بدلا من مكافحة PV الأضداد للكشف عن الكهروضوئية 2. هذا يسمح للتفاعل معينة من الجسيمات الجيلاتين مع توعية الكهروضوئية مع تقارب موحد لجميع الأنماط المصلية الثلاثة 3-6 الكهروضوئية. استخدمنا نموذج immunoadhesin من PVR (PVR - IgG2a) للتوعية جزيئات الجيلاتين ، وذلك لأن من أشكال موحودي PVR والانتماءات فقط معتدلة إلى موقع واحد ملزم على الفيريون (التفكك المستمر لل10 -7 -8 ~ M) 7 8 ، ولا...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> فهرس العدد </th><th> تعليقات </th></tr><tr><td> توعية جيلاتين الجسيمات </td><td> شركة Fujirebio </td><td></td><td> اختبار عدة </td></tr><tr><td> إعادة العازلة </td><td> شركة Fujirebio </td><td></td><td> اختبار عدة </td></tr><tr><td> لوحة Microtitration </td><td> شركة Fujirebio </td><td></td><td> اختبار عدة </td></tr><tr><td> الأضداد المضادة للالكهروضوئية </td><td> RIVM </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

الجسيمات أسلوب التلصيق لتحديد فيروس شلل الأطفال

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

في المبادرة العالمية لاستئصال شلل الأطفال ، ومختبر التشخيص يلعب دورا حاسما من خلال عزل وتحديد الكهروضوئية من عينات البراز من الشلل الرخو الحاد (اف ب) الحالات. في منظمة الصحة العالمية (WHO) في الوقت الحاضر شبكة مختبرات شلل الأطفال ، والعزلة ، وتحديد الكهروضوئية التي يتم تنفيذها باستخدام خلية نظام الثقافة في الوقت الحقيقي وRT PCR ، على التوالي. في حقبة ما بعد القضاء على الكهروضوئية ، وتحديد إجراءات بسيطة وسريعة تكون مفيدة للتأكيد السريع لحالات شلل الأطفال في المختبرات الوطنية. في هذه الدراسة ، وسوف نعرض لإجراءات فحص رواية السلطة الفلسطينية وضعت لتحديد الكهروضوئية. ويستخدم هذا الاختبار للسلطة الفلسطينية من التفاعل جزيء الكهروضوئية (PVR) ومستقبلات الفيريون التي تقارب محددة وموحدة لجميع الأنماط المصلية الكهروضوئية. الإجراء بسيط (واحد من إجراء الخطوة رد فعل في لوحات) و (يمكن الحصول على نتائج في غضون 2 ساعة من رد الفعل) السريع ، ويلاحظ البصر نتيجة (مراقبة تراص جزيئات الجيلاتين).

يسمح للجسيمات الرواية وضعت مؤخرا تراص (السلطة الفلسطينية) مقايسة باستخدام جزيء الفيروس إلى تحديد مستقبلات سريعة وسهلة لفيروس شلل الأطفال (PV). في هذه المقالة ، سوف نعرض لإجراء فحص للسلطة الفلسطينية لتحديد الكهروضوئية.

تلعب التشخيصات المختبرية دوراً حاسماً في المبادرة العالمية لاستئصال شلل الأطفال، وذلك من خلال عزل وتحديد فيروس شلل الأطفال (PV) من عينات براز المصابين بـ... الحادة.

الهدف العام من الإجراء التالي هو التعرف السريع على عزلات فيروس شلل الأطفال باستخدام بروتوكول بسيط. نستخدم في هذا المقايسة جسيمات جيلاتينية مُحسَّسة ومغلفة بجزيئات خيمرية تحتوي على النطاق خارج الخلوي لمستقبل فيروس شلل الأطفال البشري المرتبط بـ IgG two fc. ونظرًا لأن هذه الجسيمات تمتلك ألفة موحدة لجميع الأنماط المصلية لعزلات فيروس شلل الأطفال، فإن تلاؤم الجسيمات يحدث عند التحضين مع العينات التي تحتوي على أي فيروس شلل أطفال بشري.ومع ذلك، إذا كانت هناك أجسام مضادة قادرة على التعرف على الفيروس النوعي المعزول من العينة، يحدث التحييد ويمنع التلازن؛ باستخدام هذا النظام التجريبي، يمكن إجراء تحديد سريع لعزلات فيروس شلل الأطفال في تفاعل خطوة واحدة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالفحوصات المتاحة، مثل اختبار التحييد التقليدي، تكمن في بساطة الإجراء والتفسير، بهدف تقليل الجهد المطلوب وتسريع الحصول على النتائج. لإعادة تشكيل الأجسام المضادة anti PV one و PV two و PV three، أضف 0.5 milliliters من الماء إلى كل قارورة.ثم انقُل كل محلول أجسام مضادة إلى أنابيب منفصلة تحتوي على 4.5 milliliters من وسط الصيانة. تتوفر بعض تشغيلات الأجسام المضادة لـ PV في شكل مُعاد تكوينه، وبالنسبة لهذه التشغيلات من الأجسام المضادة لـ PV، فإن إضافة الماء لإعادة التكوين ليست ضرورية.بعد ذلك، قم بتحضير خلطات بنسبة واحد إلى واحد من محلول الأجسام المضادة المدمجة بحجم نهائي قدره 3.6 milliliters في أنابيب جديدة ومصنفة. على سبيل المثال، اخلط 1.8 milliliters من anti PV one مع 1.8 milliliters من anti PV two. ولتحضير تركيبة anti PV one plus PV two، كرر هذه العملية لكل مجموعة زوجية ممكنة، وقم أيضاً بتحضير محلول يحتوي على جميع الأنواع الثلاثة من الأجسام المضادة عن طريق خلط 1.2 milliliters من كل مصل مضاد معاً.بمجرد تحضير الخلطات الأربعة بإضافة 720 µL من FCS إلى كل محلول أجسام مضادة. سيساعد ذلك في تقليل التلازن غير النوعي لجزيئات الجيلاتين بواسطة الأجسام المضادة أثناء المقايسة. يمكن تخزين تجمعات الأجسام المضادة عند درجة حرارة -20 °C حتى يتم استخدامها في مقايسة التلازن.في هذا المقايسة، نستخدم جزيئات الجيلاتين المجففة بالتجميد والمغلفة بالنطاقات خارج الخلوية لمستقبل فيروس شلل الأطفال البشري ونطاقات FC لـ IgG2 خاصة بالفأر. تأكد من استخدام دفعة واحدة من الجزيئات وعدم استخدام دفعات مختلفة في تجربة واحدة لضمان اتساق صورة التلازن؛ لإعادة تشكيل الجزيئات، أضف 1.5 milliliters من محلول إعادة التشكل المنظم إلى كل قارورة. انقر بلطف للمزج جيداً.يمكن تخزين الجسيمات المعاد تشكيلها في درجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين. أولاً، قم بتصميم تجربتك في طبق معايرة دقيقة مكون من 96 بئراً. وبالنسبة لكل عينة، سيحتوي البئر رقم واحد على الفيروس وحده.ستحتوي الآبار من رقم اثنين إلى خمسة على الفيروس بالإضافة إلى واحد من محلول الأجسام المضادة المختلطة الأربعة. تأكد من تخصيص بئر واحد كضابط سلبي يحتوي على الوسط الغذائي فقط دون فيروس أو أجسام مضادة. بمجرد تجهيز الطبق، أضف 12 µL من محلول الأجسام المضادة الصحيح إلى كل بئر من الصفوف من اثنين إلى خمسة و 12 µL من وسط النمو.أضف الوسط إلى الفيروس وحده في آبار الصف الأول، وإلى بئر التحكم السلبي في الصف السادس. بعد ذلك، أضف 12 µL من عينة الفيروس في الصفوف الخمسة الأولى، و12 µL من وسط النمو إلى بئر التحكم السلبي في الصف السادس. وبمجرد توزيع الأجسام المضادة والفيروس في الأطباق، قم بإعادة تعليق جزيئات الجيلاتين المعاد تكوينها عن طريق النقر عليها برفق، ثم أضف على الفور 25 µL من الجزيئات لكل بئر في جميع الآبار.من المهم عدم السماح للجزيئات بالترسب قبل نقلها إلى الطبق لضمان الحصول على كميات متساوية من الجزيئات في كل عين. ضع طبق المقايسة على جهاز خلط الأطباق واخلطه لمدة 30 ثانية. ثم ضع الطبق على ورقة بيضاء واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين للسماح بحدوث التلازن.من المهم عدم تحريك الطبق في أي وقت أثناء أو بعد فترة الحضانة لأن التلازن المتكون يكون غير مستقر. بمجرد حدوث التفاعل، التقط عدة صور للطبق بحيث يمكن تقدير جودة التلازن في كل بئر. في الآبار التي لم يحدث فيها تلازن، كما هو موضح هنا على اليسار، ستترسب جزيئات الجيلاتين الملونة في قاع البئر، بينما في الآبار التي حدث فيها تلازن.بسبب التفاعل بين الفيروس و pvr، وجسيمات الجيلاتين المغلفة بـ IgG two A، يظهر نمط ملون منتشر كما هو موضح في المركز. في هذه التجربة، اختبرنا قدرة المحاليل الفيروسية، PV one و two و three، على تحفيز التلازن في وجود الجسم المضاد. وبالنسبة للمجموعات الموضحة هنا في غياب الفيروس أو الأجسام المضادة، لا يحدث تلازن وترسب جسيمات الجيلاتين، وذلك على عكس الآبار التي تحتوي على الفيروس ولكن بدون أجسام مضادة.حدث التلازن نتيجة تفاعل الفيروس. ومع جزيئات الجيلاتين المغطاة بـ PVR IgG في الآبار التجريبية، يتم منع تلازن الفيروسات في أي بئر يحتوي على أجسام مضادة تعادل ذلك الفيروس بشكل محدد. فعلى سبيل المثال، يتم منع تلازن فيروس شلل الأطفال من النوع الأول في الآبار التي تحتوي على أجسام مضادة لـ PV 1، ولكن ليس في الآبار التي تحتوي فقط على أجسام مضادة لـ PV 2 و PV 3.وينطبق الأمر ذاته على النوعين الثاني والثالث من فيروس شلل الأطفال. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إجراؤها في غضون ثلاث ساعات فقط إذا نُفذت بشكل صحيح.

particle-agglutination-method-for-poliovirus-identification

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

جينوم فيروس الأنفلونزا يتكون من ثمانية مجمعات منفصلة من الحمض النووي الريبي والبروتينات ، ووصف المجمعات بروتين نووي ريبوزي الفيروسي (vRNPs). وتصف هذه الورقة تنقية التدرج الجلسرين والتصور انتقال المجهر الإلكتروني من vRNPs الأنفلونزا.

تنقية والتخيل من الأنفلونزا من المجمعات بروتين نووي ريبوزي الفيروسية

في هذه المقالة، وقدم، كمية بسيطة، وتقارب مرحلة فحص السائل الالتقاط. هذا هو أسلوب موثوق بها على أساس التفاعل بين حبات مغناطيسية والبروتينات الموسومة (على سبيل المثال nanobodies) من ناحية، والتقارب بين بروتين المفتاحية والثانية، والبروتين المسمى (مثل فيروس شلل الأطفال) من جهة أخرى.

تقارب المرحلة السائلة الفحص التقاطها باستخدام الخرز المغناطيسي لدراسة البروتين البروتين التفاعل: المثال فيروس شلل الأطفال، Nanobody

في هذا الفيديو ، نوضح مقايسة الترسيب المناعي ، تسمى مقايسة التقاط VLP ، لعزل الجسيمات الشبيهة بالفيروسات التي تعرض المستضد ، أو VLPs ، من العينة. يرتبط المستضد بأجسام مضادة محددة مرتبطة بالخرز المغناطيسي ، مما يشكل مركبا ثابتا للأجسام المضادة المستضد الذي يتم فصله لاحقا وتخزينه لمزيد من التحليل.

فحص التقاط الجسيمات الشبيهة بالفيروسات: طريقة لعزل VLPs التي تعرض المستضد من عينة باستخدام حبات مغناطيسية مترافقة بالأجسام المضادة المعادلة

يوضح هذا الفيديو مقايسة التحييد الدقيق المستندة إلى التصوير لتحليل العلاقات المستضدية بين فيروسات الأنفلونزا A و B. يوفر طريقة كمية ومرئية لتقييم فعالية الأجسام المضادة أو العلاجات الأخرى في الوقاية من العدوى الفيروسية.

تحليل العلاقة المستضدية بين الفيروسات باستخدام مقايسة التحييد الدقيق المستندة إلى الصور

باستخدام الفحص المجهري للقوة الذرية جنبا إلى جنب مع تقنية الألواح الحيوية ، أنشأنا نظاما حيويا سلبيا وإيجابيا لاكتساب أجسام مضادة ضد متغيرات البروتين الخاصة بالأمراض الموجودة في أي مادة بيولوجية ، حتى عند التركيزات المنخفضة.  لقد نجحنا في الحصول على أجسام مضادة لمتغيرات بروتين TDP-43 المشاركة في التصلب الجانبي الضموري.

رواية القوة الذرية المجهر Biopanning استنادا لعزل مورفولوجيا الكواشف محددة ضد المتغيرات TDP-43 في الضموري العضلي الجانبي التصلب

نقدم استراتيجية جديدة لعزل مقصورات التكاثر الفيروسي (RC) عن الخلايا البشرية المصابة بالفيروس الغدي (Ad). يمثل هذا النهج نظاما خاليا من الخلايا يمكن أن يساعد في توضيح الآليات الجزيئية التي تنظم تكرار الجينوم الفيروسي والتعبير عنه بالإضافة إلى تنظيم التفاعلات الفيروسية والمضيف التي تم إنشاؤها في RC.

العزلة الفيروسية النسخ المتماثل حجرة التخصيب النووي الكسور الفرعية من اتش المصابة الخلايا الطبيعية الإنسان

باستخدام استراتيجية المصفوفة الدقيقة المطبوعة للجليكان ، تم تصغير مقايسة الألواح التقليدية المكونة من 96 بئرا لتحليل شفق هيماجلوتينين فيروس الأنفلونزا A وخصوصيتها للمستقبلات المحتوية على حمض السياليك.

والمنمنمة غليكان ميكروأري الفحص لتقييم الطمع وخصوصية الأنفلونزا من الفيروسات Hemagglutinins

هنا ، ونحن وصف خليه واحده الطموح الصغير طريقه للفصل بين الأميبا المصابة. [أين وردر تو] فصلت [سوببوبولايشن] فيروسية في [ فرماميبا] [فرميفورليس ] يعدي ب [فوستوفيروس] وحميات عملاقه مجهوله, طور نحن البروتوكول مفصل أدناه ويبرهن قدرته ان يفصل اثنان [لوو-فري] رواية فيروسات عملاقه.

خليه واحده الطموح الصغير كاستراتيجية بديله لفرز الخلايا المنشطة الفلورية لفصل خليط الفيروسات العملاقة

هنا، نقدم بروتوكولا للكشف عن إزالة الأسطح المحايدة على الجسيمات الشبيهة بالفيروسات التي تعرض المستضدات (VLPs). يتم إجراء التكاثر المناعي لفيروس نقص المناعة البشرية (HIV) المشتقة من VLPs باستخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة الخاصة بالجظرات المظروفة إلى جانب الخرز المغناطيسي المقترن بالبروتين G. يتم إخضاع VLPs الملتقطة في وقت لاحق إلى SDS-PAGE والتحليل الغربي لللطخة باستخدام الأجسام المضادة للبروتين الأساسي الفيروسي Gag-specific.

الكشف عن Epitopes الحساسة للتحييد في المستضدات المعروضة على الجسيمات الشبيهة بالفيروسات (VLP) المستندة إلى اللقاحات باستخدام م المقايسة التقاط

يتم وصف بروتوكول المختبر الشامل وسير عمل التحليل لإجراء فحص سريع وفعال من حيث التكلفة ومباشر قائم على الخلايا اللونية للكشف عن العناصر المحايدة ضد AAV6.

طريقة خطوة بخطوة للكشف عن الأجسام المضادة المحايدة ضد AAV باستخدام فحص قائم على الخلايا اللونية

تصف هذه المخطوطة بروتوكولا مفصلا لتوليد وتنقية النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدي باستخدام طريقة كروماتوغرافيا تقارب محسنة قائمة على الهيبارين. إنه يقدم نهجا بسيطا وقابلا للتطوير وفعالا من حيث التكلفة ، مما يلغي الحاجة إلى الطرد المركزي الفائق. تظهر النواقل الناتجة درجة نقاء عالية ونشاطا بيولوجيا ، مما يثبت قيمتها في الدراسات قبل السريرية.

عزل النواقل الفيروسية المرتبطة بالغدي من خلال بروتوكول كروماتوغرافيا تقارب الهيبارين أحادي الخطوة وشبه آلي

تعلم تقنية التلصيق الجسيمي لتحديد فيروس شلل الأطفال بسرعة باستخدام جسيمات الجيلاتين الحساسة. تُبسّط هذه الطريقة الفحص التقليدي وتُسرّع النتائج.

الجسيمات أسلوب التلصيق لتحديد فيروس شلل الأطفال

استكشف المزيد من الفيديوهات