تذرية الليزر للاسماك الزرد سليفة الكلوة لدراسة التجديد طلائي الكلوي

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء وسم مستهدف لخلايا الكلى في الكلية الجنينية لسمكة الزيبرفيش، وهي الكلية الأولية (pro nephros)، وذلك لغرض دراسة تجديد الظهارة الكلوية بعد إصابة الكلى الحادة. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق حقن أجنة سمكة الزيبرفيش مجهرياً بمركب ديكستران فلورسنتي مقترن. وخلال فترة تحضين ليلة كاملة، يتم امتصاص هذه المقترنات بشكل انتقائي بواسطة خلايا الأنابيب القريبة في النيفرون.

في اليوم التالي، يتم فحص الخلايا تحت المجهر الفلوري العكسي (epi fluorescence) ويتم استئصال خلايا مختارة باستخدام نظام ليزر نبضي. لاحقاً، يتم تقييم التغيرات المورفولوجية والجزيئية باستخدام علم الأنسجة، والتهجين الموضعي C two في العينات الكاملة، والكيمياء النسيجية المناعية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل إحداث إصابة كلوية حادة باستخدام المضاد الحيوي السام للكلى gentamicin، هي أن مثل هذه العلاجات تسبب تلفاً كارثياً وتكون قاتلة، مما يمنع تحليل أحداث التجدد الكلوي بمرور الوقت.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال الكلى، مثل تحديد أحداث الإشارات الجزيئية التي تحدث أثناء تجدد الخلايا الظهارية. لقد خطرت لنا الفكرة الأولى لهذه التقنية عندما أردنا تطوير تحليل مفصل لتجدد الخلايا الظهارية الكلوية في أطباق بيتري. قم بجمع أجنة zebrafish المخصبة في محلول E3 المعدل بدون ميثيلين الأزرق.

يتم تحضين الأجنة المخصبة عند درجة حرارة 28.5 درجة مئوية حتى يمر على تخصيبها ما بين 48 و55 ساعة، وهي المرحلة التي يبدأ فيها الجهاز الكلوي للجنين في العمل. قبل البدء في عمليات الحقن، يتم تجهيز شجرة حقن للأجنة باستخدام قالب يحتوي على تجاويف مثلثية لتثبيت الأجنة. بعد ذلك، يتم تجهيز إبر الحقن المجهري القياسية ومحلول الحقن لوسم الأنيبيبات القريبة. تبدأ التجربة بتجهيز الأجنة.

أولاً، قم بإزالة الـ Corian من أي بيوض غير فقس باستخدام ملقط دقيق. ثم اشطف بقايا الـ Corian، والبقايا الموجودة في طبق بتري، وأعد ملء الطبق بـ 30 milliliters من محلول E three المعدل. ثانياً، قم بتخدير اليرقات باستخدام 5 milliliters من الـ trica.

تأكد من تخدير اليرقات تماماً من خلال التحقق من استجابتها للمس؛ فإذا لم تكن مخدّرة بالكامل، فسترتجف أثناء عملية الحقن. ثالثاً، ضع اليرقات في القالب باستخدام ماصة نقل بلاستيكية.

ضع الحيوانات بحيث تكون رؤوسها في أعمق جزء من التجويف وجذوعها على طول جانب البئر. ابدأ الآن بعمليات الحقن المجهري داخل العضلات عن طريق تحميل إبرة مُجهزة من اثنين إلى ثلاثة µL من dextran fluoresce، ثم ضع الإبرة في موضعها واحِقن حوالي 1 nL من المحلول في منطقة trunk so mite لكل حيوان. يتم إدخال dextran conjugates بسهولة عبر عملية الالتقام الخلوي بواسطة الأنبوب القريب للكلية (nephron proximal tubule)، مما يتيح الوسم التفضيلي لهذه المجموعة من الخلايا الظهارية.

استهدف الجزء العلوي من القطعة الجسمية (somite) وتجنب تمدد كيس المح، وإلا ستتعرض أنابيب الكليون (nephron tubules) للتمزق، كما هو موضح في هذا الحيوان الذي حُقن بشكل غير صحيح. بمجرد حقن اليرقات، انقلها إلى طبق بيتري نظيف واشطفها ثلاث مرات بوسط E3 الطازج لإزالة جميع آثار التريكان. الآن، غطِّ الغطاء بورق القصدير وحضن الحيوانات طوال الليل عند درجة حرارة 28 °C.

قبل البدء في هذا الإجراء، قم بتحضير وسط التثبيت، واحتفظ ببعض الأجزاء منه للاستخدام الفوري في درجة حرارة الغرفة، مع حفظ الأجزاء المتبقية في درجة حرارة 4 °C للتخزين طويل الأمد. ابدأ بتخدير يرقات zebra fish باستخدام 5 mL من trica في 30 mL من E3. وكما في السابق، تأكد من عدم استجابة الأسماك للمؤثرات اللمسية.

افحص الآن الحيوانات المحقونة باستخدام الفلورة لاختيار اليرقات التي تظهر فيها الأنابيب القريبة بوضوح. انقل ما يصل إلى 12 يرقة إلى طبق جديد يحتوي على نفس تركيز trica باستخدام مجهر فلوري مركب مجهز بمرشح fitzy، وإضاءة المجال المضيء، وليزر perform. تبدأ عملية الاستئصال بنقل اليرقات وتخديرها في طبق يحتوي على وسط التثبيت.

وانتظر لمدة دقيقتين، ثم انقل اليرقة إلى شريحة زجاجية ذات تجويف تحتوي على قطرة من وسط التثبيت. قم بوضع الحيوان برفق بحيث يكون الجانب الظهري للأعلى باستخدام مسبار دقيق، ثم ركز على الجانب الظهري. الآن، وباستخدام نظام ليزر نقطي دقيق نبضي ومعاير، قم باستئصال أحد النفرونات مع ترك الآخر سليماً ليكون بمثابة عينة ضابطة.

ستلاحظ تشتت الفلورة مع استئصال الخلايا الظهارية الكلوية. بعد ذلك، انقل الحيوان برفق إلى فجوة في طبق 12 well، واشطفه ثلاث مرات في وسط E3 لإزالة ميثيل السليلوز. استمر في استئصال النفرونات حتى يمتلئ طبق 12 well الأول.

بعد ذلك، يتم تخدير 12 حيواناً آخر وتكرار العملية. حُقن Dextra Fitzy لوسم الأنبوب القريب بشكل تفضيلي. وبعد ثلاثة أيام من الإخصاب، تم استئصال نيفيرون كل حيوان باستخدام الليزر.

بعد يوم واحد من الاستئصال. لا يظهر التجدد بعد أربعة أيام من الاستئصال، ومع ذلك، فقد حدث التجدد بعد استئصال الخلايا في الموقع الثاني. استُخدم التهجين لتحليل التغيرات في العينات المثبتة في نقاط زمنية محددة.

لم يخضع هذا الجنين لعملية الاستئصال. وفي المقابل، تم استئصال جزء كبير من الظهارة الأنبوبية في هذا الجنين، بينما تم استئصال جزء قصير من الظهارة الأنبوبية في هذا الجنين. وعقب هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل التهجين الموضعي للعينة الكاملة للإجابة على أسئلة إضافية، مثل تحديد التغيرات في التعبير الجيني أثناء مسار تجدد الكبيبة الكلوية.

لا تنسَ أن العمل مع المواد الكيميائية قد يكون خطيراً للغاية. لذا، يُوصى باتخاذ الاحتياطات اللازمة خلال هذا الإجراء، مثل ارتداء معدات الوقاية الشخصية كمعطف المختبر والقفازات.