أسلوب الرواية تطوير أدوية لمكافحة السرطان باستخدام Explants ورم العينات الجراحية

الهدف العام من هذا الإجراء هو وضع منهجية جديدة لاختبار فعالية الأدوية باستخدام عينات جراحية من أورام الدماغ تسمى طريقة استئصال الورم X. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تأمين عينات جراحية مستأصلة حديثاً من الأورام الدبقية الخبيثة أثناء الجراحة لإجراء التجارب قبل السريرية. بعد ذلك، يتم نقل العينات إلى مرفق نواة توريد الأنسجة لفصلها لأغراض التشخيص السريري وأغراض البحث.

بعد ذلك، في المختبر البحثي، يتم تشريح المستأصلات الورمية إلى عدة أنسجة أصغر ونقلها إلى وسط مُحسَّن. وأخيراً، تُجرى حقن داخل الورم بمرشحات دوائية وتُحضن المستأصلات لمدة 16 ساعة. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تكشف عن فعالية العلاج من خلال صبغ الهيماتين والإيوسين، بالإضافة إلى الكيمياء النسيجية المناعية باستخدام واسمات محددة لأنواع الخلايا.

يمكننا أيضاً تقييم فعالية الدواء في المختبر باستخدام قياس التدفق الخلوي ومقايسات تكوين الكرات العصبية. وتترك غالبية مقايسات فعالية الأدوية الحالية فجوة بين فعالية الدواء في النماذج التجريبية قبل السريرية الحالية وفعاليته لدى المرضى. وبشكل خاص، عندما نختبر الأدوية المرشحة على السرطانات الصلبة مثل الأورام الدبقية الخبيثة، فلا يمكننا الاستهانة بالتبادلات الإشارية بين الخلايا وكذلك داخل الخلايا.

من أجل تجنب تدمير البيئة الدقيقة للأورام الصلبة، قمنا بتأسيس طريقة استزراع باستخدام عينات من الأورام المستأصلة. بعد إزالة الأورام من المرضى، يتم نقل العينات من أو إلى قسم علم الأمراض، حيث نقسم كتل الورم إلى قطعتين؛ تُستخدم عينة الورم من القطعة الأولى لعمل المقاطع المجمدة والتضمين في البارافين من أجل التشخيص السريري، بينما تُرسل بقية أنسجة الورم إلى المختبرات البحثية ليستخدمها الباحثون.

باستخدام هذه الطريقة، يمكننا الحفاظ على البيئة المجهرية للورم مع الخلايا البطانية والمناعية المجاورة للورم، بالإضافة إلى خلايا الدماغ الطبيعية التي تحيط بالورم أو تهاجر إلى تجاويف الورم. قبل معالجة نسيج الورم الأرومي الدبقي، قم بتحضير المحلول السائل، والوسط، ومحلول الآجار، ثم اخلطهم بنسبة واحد إلى واحد.

ثم أضف 1 mL إلى كل بئر من أطباق الستة آبار. بعد استلام نسيج الورم الأرومي الدبقي متعدد الأشكال الطازج، انقله إلى أطباق بتري باستخدام الملاقط واغسله بعناية ثلاث مرات باستخدام 5 mL من محلول PBS (بتركيز 1x) البارد جداً بواسطة شفرة جراحية وملاقط. قم بقص مقاطع متسلسلة بقطر يبلغ حوالي 10 mm من العينات المشرحة لتكوين كتل ورمية، وانقل كل كتلة إلى بئر واحد من طبق الستة آبار الذي يحتوي على وسط الآجار، مع السماح لها بالتعرض الكافي للهواء للحفاظ على حيويتها.

بعد ذلك، وباستخدام حقنة إنسولين سعة 1 مل وإبرة مقاس 28 عيار بنصف بوصة، يتم حقن كتل الورم ثلاث مرات باستخدام 5% DMSO أو 2.5 nanomolar من عقار temozolomide أو عقار واعد جديد مضاد للسرطان، ثم تُحضن لمدة 16 ساعة عند 37 °C في هواء رطب يحتوي على 5% carbon dioxide. بعد التحضين، تُغسل الكتل ثلاث مرات باستخدام 5 ml من 1× PBS. ثم يتم تثبيت الكتل في أنابيب سعة 50 ml باستخدام 10 ml من 10% volume per volume فورمالدهيد لمدة 24 ساعة.

يتم صب الأنسجة في البارافين، ثم تُقطع مقاطع بسمك أربعة ميكرون، وتُجرى لها عملية إزالة البارافين وإعادة الترطيب. توضع الشرائح في حامل وتُحضن في المحاليل التالية: يُستخدم الزيلين ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في كل مرة.

إيثانول 100% ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في كل مرة. إيثانول 95% مرة واحدة لمدة خمس دقائق، وإيثانول 70% مرة واحدة لمدة خمس دقائق. وأخيرًا، الشطف بمياه الصنبور الجارية لمدة ثلاث دقائق.

يرجى مراجعة البروتوكول المكتوب المرفق للحصول على تفاصيل حول استعادة المستضد وتثبيط البيروكسيد الداخلي. ولحجب المقاطع، قم بتغطية الأنسجة بمصل ماعز طبيعي بتركيز 10%، ثم انقل الشرائح إلى صندوق رطب واحضنها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام PBS بتركيز مرة واحدة لمدة خمس دقائق في كل مرة.

بعد ذلك، أضف الأجسام المضادة الأولية مثل caspase three الخاص بالبشر أو KI 67 المخففة باستخدام 1× PBS، ثم حضّنها طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. وفي اليوم التالي، اشطف الشرائح باستخدام 1× PBS ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في كل مرة. بعد ذلك، غطِّ الأنسجة بنقطتين إلى ثلاث نقاط من الجسم المضاد الثانوي الموسوم بـ HRP.

ضع الشرائح في صندوق رطب واحضنها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. اغسلها بمحلول PBS مرة واحدة، ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في كل مرة. قم بتظهير العينات باستخدام مجموعة كاشف الكروموجين DAB وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة من أجل الصبغات المضادة.

اغمر الشرائح في الهيماتين لمدة 10 إلى 15 ثانية. ثم اشطفها بماء الصنبور الجاري لمدة ثلاث دقائق. قم بتجفيف العينات عن طريق غمر الشرائح في المحاليل التالية، متبوعةً بكاشف التثبيت وغطاء الشريحة.

ثم استخدم مجهر الفلوريسنت لتصوير الشرائح. تُظهر صورة الرنين المغناطيسي الموزونة T1 مع تعزيز الغادولينيوم في هذا الشكل ورم أرومة دبقية متعدد الأشكال أو GBM معزز في الفص الجبهي الأيمن لمريض قبل الجراحة. وقد أكدت الصورة بعد الجراحة الاستئصال الجزئي للآفة بعد العملية الجراحية.

يُظهر صبغ الهيماتوكيسلين والإيوسين وجود تنخر، وخلايا سياجية كاذبة، وتكاثر وعائي دقيق. وبناءً على ذلك، تم تشخيص هذه الأورام نسيجياً على أنها ورم أرومي دبقي (GBM) للتحقق مما إذا كان يمكن استخدام عينات استئصال الورم هذه بشكل موثوق. ولغرض اختبار فعالية الدواء، اختبرنا تأثير عقار تيموزولوميد (TMZ)؛ حيث أظهر الكيمياء النسيجية المناعية لأنسجة GBM المعالجة بـ TMZ انخفاضاً ملحوظاً في عدد الخلايا الورمية الموجبة لـ KI 67 مقارنة بعينات المجموعة الضابطة.

وفي المقابل، لم يُظهر الفحص الكيميائي النسيجي المناعي باستخدام واسم الاستماتة caspase three أي فرق جوهري بين عينات الورم الدبقي المعالجة بـ TMZ والعينات الضابطة. ويمكن توصيف تأثير العلاج بـ temozolomide بشكل أكبر من خلال دمج هذا الفحص خارج الجسم (ex explan) مع الزرع المختبري (in vitro) أو قياس التدفق الخلوي. كما يمكننا مقارنة طريقة ex explan هذه مع زراعة الطعوم الغريبة (xenograft) وفحص تكوين الكرات المختبري (in vitro) لفرز العوامل المبتكرة المضادة للسرطان.

بمجرد الحصول على أنسجة الورم في المختبر، يمكن إتمام إجراء هذه التجربة في غضون ساعة واحدة. يعد هذا المقايسة الجديدة سهلة التنفيذ نسبيًا وقابلة للتكرار بعد تفكيك الغرسات الورمية المعالجة. ويمكننا دمجها مع التجارب المخبرية (in vitro).

تتمثل الميزة الرئيسية لهذا المقايسة في أنها تحافظ على البيئة المجهرية للورم. لقد حصلنا على بيانات إيجابية باستخدام مستنبتات أورام معالجة بـ Temodar، والتي كانت متوافقة مع نتائج المرضى أنفسهم الذين خضعوا لعلاج Temodar بعد العمليات الجراحية. وأخيرًا، يمكن تطبيق هذه الطريقة على أنواع أخرى من السرطانات الصلبة، وبالتالي قد يكون لها القدرة على تسريع عملية تحديد عوامل علاج كيميائي جديدة لعلاج السرطانات الصلبة.