Electroporation في الجسم الحي من الشبكية ماوس النامية

وهناك طريقة لدمج الحمض النووي في خلايا الشبكية البلازميد الفئران لغرض تنفيذ إما مكسب أو خسارة للدراسات وظيفة

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء تجربة التثقيب الكهربائي في الجسم الحي على الفئران حديثي الولادة من أجل إدخال مادة وراثية بثبات في خلايا شبكية العين. يتم تحقيق ذلك عن طريق التخدير الأول ، وهو فأر حديث الولادة ينبثق على الجليد لمدة خمس إلى 10 دقائق تقريبا. الخطوة الثانية من الإجراء هي تحديد تقاطع الجفون المنصهرة وفتح العين عن طريق القطع على طول هذا التقاطع.

ثم يتم إجراء شق في العين لتسهيل إدخال حقنة الحقن المجهري. ثم يتم إدخال حقنة الحقن الدقيقة من خلال الشق وحقن محلول الحمض النووي في الفضاء تحت الشبكية. أخيرا ، يتم وضع قطب كهربائي للملاقط على رأس البوب ويتم توصيل سلسلة من النبضات الكهربائية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل نقل الفيروسات القهقرية ، هي أن التثقيب الكهربائي في الجسم الحي لا يتطلب توليد العوامل البيولوجية والتعامل معها كأدوات لتوصيل الجينات. نتيجة لذلك ، تتطلب هذه التقنية عمالة أقل ، وكواشف أقل ، ويمكن إجراؤها في أي محطة عمل معتمدة لإجراءات. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه التقنية لأن الأمر يستغرق وقتا وتكرارا لتطوير شعور بوضع حقنة الحقن المجهرية في الفضاء تحت الشبكية.

سيوضح الإجراء جيمي ديميلو ، زميل ما بعد الدكتوراه في مختبري. نظرا لأن تركيز الحمض النووي المطلوب للتثقيب الكهربائي مرتفع نسبيا ، يتم أولا تضخيم الحمض النووي البلازميد المطلوب للخلايا غير الكفؤة المستخرجة باستخدام إعداد ماكسي ، ثم تنقيته وتركيزه إلى حوالي خمسة ميكروغرام لكل ميكرولتر. تتم إضافة صبغة FCF الخضراء السريعة كتتبع حقن.

بمجرد تحضير الحمض النووي البلازميد ، قم بتخدير صغار الفئران حديثي الولادة على الجليد لمدة خمس دقائق تقريبا ، ومراقبتهم حتى يتم تأكيد فقدان الوعي عن طريق ضغط وسادة القدم. قم بتبديل منطقة العين المراد حقنها بالكحول الجانبي isop بنسبة 70٪ ، واستخدم مجهر تشريح لتحديد ظهارة FUS الوصلية حيث تلتقي الجفون. باستخدام إبرة حادة قياس 30 ، افتح العين بعناية عن طريق القطع على طول الظهارة الوصلية المنصهرة دون الضغط المفرط لأسفل أو القطع خارج نطاق الجفن.

بمجرد فتح الجفن وتعرض العين ، استخدم طرف الإبرة لعمل شق صغير في الصلبة بالقرب من التقاطع مع الحرص على القرنية عدم اختراق العدسة بعمق وثقبها. أدخل إبرة الحقن الحادة في الشق. فقط حتى يتم الشعور بمقاومة الجدار الصلبي المقابل ، قم بحقن 0.3 ميكرولتر من محلول الحمض النووي اللزج ببطء في الفضاء تحت الشبكية.

مع الحرص على عدم الضغط بإحكام شديد على جدار الصلبة ، قم بتدوير للتحقق من الانتشار المتساوي لمحلول الحمض النووي داخل شبكية العين. أولا ، انقع قطب الملقط في PBS لزيادة التوصيل الكهربائي. ثم ضع رأس الجرو المحقون بين الأقطاب الكهربائية مع العين المحقونة المجاورة لقطب القطب الموجب والعين غير المحقونة المجاورة لقطب القطب السالب.

قم بتطبيق خمس نبضات مربعة باستخدام مولد نبض بحيث تكون مدة كل نبضة 80 فولت و 50 مللي ثانية مع فاصل زمني قدره 950 مللي ثانية بين النبضات. أخيرا ، قم بتسخين الجراء تحت مصباح الاحترار حتى يتعافوا من التخدير الجليدي. عند الشفاء ، أعد الجراء المثقلة بالكهرباء إلى والدتهم في اليوم الثالث بعد الولادة.

غالبية الخلايا الكهربائية EGFP في طبقة التنسج العصبي للشبكية ولا تظهر خصائص مورفولوجية مميزة لأي من الخلايا الدبقية العصبية المتمايزة في شبكية العين. بحلول اليوم 14 بعد الولادة ، يمكن العثور على الخلايا الكهربائية في الطبقة النووية الخارجية والطبقة النووية الداخلية لشبكية العين والخلايا المختلفة المصنفة. اعرض الآن السمات المورفولوجية المميزة للخلايا العصبية المتمايزة.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم تنفيذ جميع الخطوات بسلاسة وبشكل متساو. من السهل جدا إتلاف شبكية العين أثناء الحقن المجهري ، والممارسات المطلوبة لتطوير البراعة اليدوية اللازمة لتجنب تلف الأنسجة. باتباع هذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل الكيمياء المناعية أو التهجين في الموقع من أجل تحديد ما إذا كان التعبير عن الجينات ذات الأهمية منظما لأعلى أو لأسفل في شبكية العين الكهربائية.