الوقت الفاصل بين مرحلة التطور الجنيني المبكر من الميكروسكوب في انواع معينة ايليجانس

الهدف العام من التجربة التالية هو تسجيل الأحداث تحت الخلوية خلال التطور الجنيني المبكر Insino Ratu الأناقة. يتم تحقيق ذلك باستخدام سلالات معدلة وراثيا مع بروتينات متعددة مصنفة بالفلورسنت تسمح بتصور الحمض النووي بالإضافة إلى مجموعات فرعية من الحويصلات في الجنين المبكر ، يتم تمييز عضيات معينة عن طريق الحقن المجهري للأصباغ الفلورية ، مثل Lyo tracker أو MIT tracker في الغدد التناسلية للدودة البالغة. بعد ذلك ، يتم قطع الأجنة من الديدان البالغة ومراقبتها باستخدام مجهر متحد البؤر للحصول على تسجيلات بفاصل زمني لحركات البروتينات المسماة في العضيات.

في النهاية ، يكشف البروتوكول عن حركة مثيرة للاهتمام للجسيمات الحالة والحويصلات الموسومة ب GFP أثناء التطور المبكر في مسببات الحساسية CL. اسمي كوني هيدجر، واليوم سأريكم كيف نجري الفحص المجهري بفاصل زمني في مختبرنا، مختبر بويد في جامعة ألاباما في هانتسفيل. في هذه التجربة ، التقط الديدان الخيطية الإجمالية على ألواح NGM الزراعية ، جالسة مع عشب بكتيري OP 50 عند 25 درجة مئوية في اليوم السابق للتجربة ، ما لا يقل عن 40 لترا من أربع يرقات على ألواح جالسة واحتضانها طوال الليل عند 25 درجة مئوية.

ستكون هذه الديدان من الشباب البالغين. للتجربة. اصنع وسادة حقن عن طريق الساندويتش ، قطرتين من 2٪ aros في الماء من ماصة سابقة بين زلاقتين زجاجيتين للغطاء ، والضغط لتشكيل agros في دائرة قطرها 1.5 سم.

قم بإزالة زلة الغطاء العلوي وجفف الوسادة عن طريق وضعها في فرن 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ، أو اتركها على سطح الطاولة طوال الليل. في يوم الحقن ، قم بإعداد جهاز تعقب MIT المخفف أو محلول صبغة Lyo Tracker واسحب إبر الحقن من شعرية زجاجية 1.2 od. قم بإعادة ملء الإبر بمحلول صبغة مخفف وتخزينها في إبرة حقن مثبتة في غرفة رطبة داكنة على المناور الصغير وقم بتوصيل الإبرة بمنظم ضغط بأنبوب بقطر داخلي 1.2 ملم.

الآن ضع قطرتين من الزيت المعدني الثقيل على وسادة الحقن. ضع وسادة الحقن على المجهر وقم بخفض الإبرة في الزيت. استخدم ضغط الحقن ولاحظ ما إذا كان السائل يتدفق من الإبرة.

إذا لم يكن الأمر كذلك ، فستحتاج إلى كسر نهاية الإبرة برفق عن طريق دفع الطرف برفق إلى جزء صغير من زجاج الغطاء المكسور الموضوع على وسادة الحقن. بعد تدفق الإبرة ، استمر في الحقن قبل ساعة واحدة من مشاهدة الأجنة. استخدم صورة لنقل الديدان الصغيرة إلى قطرة الزيت على وسادة الحقن.

رتب ثلاث إلى 10 ديدان بالتوازي وأقل بقليل من طول دودة واحدة. من المهم الآن حقن الديدان بسرعة قبل أن تجف الديدان. انقل الوسادة مع الديدان إلى مرحلة المجهر.

ركز على الجزء المركزي من الغدد التناسلية البعيدة. ثم استخدم المعالج الصغير لتحريك طرف الإبرة إلى نفس المستوى البؤري. ثقب الدودة عن طريق تحريك المرحلة أفقيا.

عندما يكون طرف الإبرة داخل cus ، اضغط لملء الغدد التناسلية بخليط الصبغة. سوف يتمدد الغدد التناسلية مع حجم الحقن. المضي قدما في الحقن.

كلاهما يذهب إلى أذرع صافية لكل دودة بعد الحقن. قم بتغطية الديدان ب 0.5 مل من عازلة البيض. باستخدام ماصة المراعي المسحوبة ، ثم اترك الديدان تتعافى لمدة ساعة إلى ساعتين في درجة حرارة الغرفة في غرفة رطبة خالية من الضوء.

ابدأ بإعداد وسادة agros جديدة لعرض الأجنة المحقونة بماصة سابقة. ضع ثلاث قطرات من agros المنصهر على شريحة مجهر نظيفة وضع تلك الشريحة بين شريحتين أخريين ملفوفتين في طبقة واحدة من الملصقات. شريط الشريط يتحكم في سمك الوسادة.

بعد ذلك ، اضغط على المجهر النظيف لأسفل على قطرات agros بحيث تستقر على شرائح الشريط. لا تقم بإزالة الشريحة العلوية حتى تصبح الأجنة جاهزة للتركيب. الآن قم بإسقاط 20 ميكرولترا من محلول البيض في وسط زجاج الغطاء وانقل الديدان المحقونة إلى المخزن المؤقت تحت مجهر تشريح ، اقطع الديدان بالقرب من الفرج.

باستخدام إبرة تحت الجلد عيار 26 ، سوف تتسرب الأجنة من الدودة. الآن قم بإزالة الشريحة العلوية لشريحة التصوير وقم بخفض وسادة aros رأسا على عقب على زجاج الغطاء مع الأجنة. إذا تم تصوير الأجنة على مدى فترة طويلة من الزمن ، فقم بإغلاق حواف زجاج الغطاء بالفازلين لمنع الجفاف.

الآن ، ابدأ التصوير عن طريق تحديد موقع الأجنة تحت هدف 10 × للعثور على أجنة في المرحلة المبكرة ، وابحث عن الأجنة التي هي في طور إكمال الانقسام الاختزالي للأم. يمكن تمييز الأجنة العضلية عن الأجنة اللاحقة لأنها لم تخضع للتقصير. بعد الانتهاء من الانقسام الاختزالي ، هناك فجوة كبيرة بين غشاء الخلية وقشر البيض في الطرف الأمامي من الجنين.

بمجرد تحديد الجنين الذي تم تنظيمه بشكل مناسب ، انتقل إلى عدسة تكبير أعلى لتسجيل التطور الجنيني. يعبر هذا الجنين عن كل من البروتينات الموسومة بالكرز M و B و GFP ubiquitin. يمكن رؤية الحمض النووي للأم والأب عبر M cherry H two B ، وبالتالي يظهر مراحل التطور المبكر.

تم حقن هذا الجنين باللون الأزرق OC Tracker ويعبر عن GFP Ubiquitin. تم جمع الصور باستخدام عدسة NA مقاس 63 × 1.4 مع 4 88 و 5 55 ليزر تم ضبطها بأقل قدر من الطاقة وأقصى كسب. عادة ، يتم جمع Zacks كل 10 إلى 15 ثانية لمدة تصل إلى 60 نقطة زمنية قبل حدوث التبييض الضوئي.

بالنسبة لفيديو اللقطات المتتابعة هذا، تم طي مكدسات Z إلى صور عرض قصوى أثناء تنفيذ اللقطات المتتابعة. يجب أن تبدأ أجنة الفحص المجهري في الهجرة النووية في غضون بضع دقائق من إكمال العضل الثاني ، وفي غضون 20 دقيقة. يجب أن يبدأ الحركية الخلوية الأولى.

إذا لاحظت توقف نمو الأجنة ، فحاول تقليل شدة الليزر أو استخدم وسادة شجيرة أكثر سمكا.