الوقت الفاصل بين مرحلة التطور الجنيني المبكر من الميكروسكوب في انواع معينة ايليجانس
August 25th, 2011
توضح هذه المقالة تقنية لتصور الأحداث المبكرة من التطور الجنيني في الخيطية انواع معينة ايليجانس.
الهدف العام من التجربة التالية هو تسجيل الأحداث تحت الخلوية خلال التطور الجنيني المبكر Insino Ratu الأناقة. يتم تحقيق ذلك باستخدام سلالات معدلة وراثيا مع بروتينات متعددة مصنفة بالفلورسنت تسمح بتصور الحمض النووي بالإضافة إلى مجموعات فرعية من الحويصلات في الجنين المبكر ، يتم تمييز عضيات معينة عن طريق الحقن المجهري للأصباغ الفلورية ، مثل Lyo tracker أو MIT tracker في الغدد التناسلية للدودة البالغة. بعد ذلك ، يتم قطع الأجنة من الديدان البالغة ومراقبتها باستخدام مجهر متحد البؤر للحصول على تسجيلات بفاصل زمني لحركات البروتينات المسماة في العضيات.
في النهاية ، يكشف البروتوكول عن حركة مثيرة للاهتمام للجسيمات الحالة والحويصلات الموسومة ب GFP أثناء التطور المبكر في مسببات الحساسية CL. اسمي كوني هيدجر، واليوم سأريكم كيف نجري الفحص المجهري بفاصل زمني في مختبرنا، مختبر بويد في جامعة ألاباما في هانتسفيل. في هذه التجربة ، التقط الديدان الخيطية الإجمالية على ألواح NGM الزراعية ، جالسة مع عشب بكتيري OP 50 عند 25 درجة مئوية في اليوم السابق للتجربة ، ما لا يقل عن 40 لترا من أربع يرقات على ألواح جالسة واحتضانها طوال الليل عند 25 درجة مئوية.
ستكون هذه الديدان من الشباب البالغين. للتجربة. اصنع وسادة حقن عن طريق الساندويتش ، قطرتين من 2٪ aros في الماء من ماصة سابقة بين زلاقتين زجاجيتين للغطاء ، والضغط لتشكيل agros في دائرة قطرها 1.5 سم.
قم بإزالة زلة الغطاء العلوي وجفف الوسادة عن طريق وضعها في فرن 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ، أو اتركها على سطح الطاولة طوال الليل. في يوم الحقن ، قم بإعداد جهاز تعقب MIT المخفف أو محلول صبغة Lyo Tracker واسحب إبر الحقن من شعرية زجاجية 1.2 od. قم بإعادة ملء الإبر بمحلول صبغة مخفف وتخزينها في إبرة حقن مثبتة في غرفة رطبة داكنة على المناور الصغير وقم بتوصيل الإبرة بمنظم ضغط بأنبوب بقطر داخلي 1.2 ملم.
الآن ضع قطرتين من الزيت المعدني الثقيل على وسادة الحقن. ضع وسادة الحقن على المجهر وقم بخفض الإبرة في الزيت. استخدم ضغط الحقن ولاحظ ما إذا كان السائل يتدفق من الإبرة.
إذا لم يكن الأمر كذلك ، فستحتاج إلى كسر نهاية الإبرة برفق عن طريق دفع الطرف برفق إلى جزء صغير من زجاج الغطاء المكسور الموضوع على وسادة الحقن. بعد تدفق الإبرة ، استمر في الحقن قبل ساعة واحدة من مشاهدة الأجنة. استخدم صورة لنقل الديدان الصغيرة إلى قطرة الزيت على وسادة الحقن.
رتب ثلاث إلى 10 ديدان بالتوازي وأقل بقليل من طول دودة واحدة. من المهم الآن حقن الديدان بسرعة قبل أن تجف الديدان. انقل الوسادة مع الديدان إلى مرحلة المجهر.
ركز على الجزء المركزي من الغدد التناسلية البعيدة. ثم استخدم المعالج الصغير لتحريك طرف الإبرة إلى نفس المستوى البؤري. ثقب الدودة عن طريق تحريك المرحلة أفقيا.
عندما يكون طرف الإبرة داخل cus ، اضغط لملء الغدد التناسلية بخليط الصبغة. سوف يتمدد الغدد التناسلية مع حجم الحقن. المضي قدما في الحقن.
كلاهما يذهب إلى أذرع صافية لكل دودة بعد الحقن. قم بتغطية الديدان ب 0.5 مل من عازلة البيض. باستخدام ماصة المراعي المسحوبة ، ثم اترك الديدان تتعافى لمدة ساعة إلى ساعتين في درجة حرارة الغرفة في غرفة رطبة خالية من الضوء.
ابدأ بإعداد وسادة agros جديدة لعرض الأجنة المحقونة بماصة سابقة. ضع ثلاث قطرات من agros المنصهر على شريحة مجهر نظيفة وضع تلك الشريحة بين شريحتين أخريين ملفوفتين في طبقة واحدة من الملصقات. شريط الشريط يتحكم في سمك الوسادة.
بعد ذلك ، اضغط على المجهر النظيف لأسفل على قطرات agros بحيث تستقر على شرائح الشريط. لا تقم بإزالة الشريحة العلوية حتى تصبح الأجنة جاهزة للتركيب. الآن قم بإسقاط 20 ميكرولترا من محلول البيض في وسط زجاج الغطاء وانقل الديدان المحقونة إلى المخزن المؤقت تحت مجهر تشريح ، اقطع الديدان بالقرب من الفرج.
باستخدام إبرة تحت الجلد عيار 26 ، سوف تتسرب الأجنة من الدودة. الآن قم بإزالة الشريحة العلوية لشريحة التصوير وقم بخفض وسادة aros رأسا على عقب على زجاج الغطاء مع الأجنة. إذا تم تصوير الأجنة على مدى فترة طويلة من الزمن ، فقم بإغلاق حواف زجاج الغطاء بالفازلين لمنع الجفاف.
الآن ، ابدأ التصوير عن طريق تحديد موقع الأجنة تحت هدف 10 × للعثور على أجنة في المرحلة المبكرة ، وابحث عن الأجنة التي هي في طور إكمال الانقسام الاختزالي للأم. يمكن تمييز الأجنة العضلية عن الأجنة اللاحقة لأنها لم تخضع للتقصير. بعد الانتهاء من الانقسام الاختزالي ، هناك فجوة كبيرة بين غشاء الخلية وقشر البيض في الطرف الأمامي من الجنين.
بمجرد تحديد الجنين الذي تم تنظيمه بشكل مناسب ، انتقل إلى عدسة تكبير أعلى لتسجيل التطور الجنيني. يعبر هذا الجنين عن كل من البروتينات الموسومة بالكرز M و B و GFP ubiquitin. يمكن رؤية الحمض النووي للأم والأب عبر M cherry H two B ، وبالتالي يظهر مراحل التطور المبكر.
تم حقن هذا الجنين باللون الأزرق OC Tracker ويعبر عن GFP Ubiquitin. تم جمع الصور باستخدام عدسة NA مقاس 63 × 1.4 مع 4 88 و 5 55 ليزر تم ضبطها بأقل قدر من الطاقة وأقصى كسب. عادة ، يتم جمع Zacks كل 10 إلى 15 ثانية لمدة تصل إلى 60 نقطة زمنية قبل حدوث التبييض الضوئي.
بالنسبة لفيديو اللقطات المتتابعة هذا، تم طي مكدسات Z إلى صور عرض قصوى أثناء تنفيذ اللقطات المتتابعة. يجب أن تبدأ أجنة الفحص المجهري في الهجرة النووية في غضون بضع دقائق من إكمال العضل الثاني ، وفي غضون 20 دقيقة. يجب أن يبدأ الحركية الخلوية الأولى.
إذا لاحظت توقف نمو الأجنة ، فحاول تقليل شدة الليزر أو استخدم وسادة شجيرة أكثر سمكا.
نظرة عامة
تصف هذه المقالة تقنية لتصوير أحداث تطور الجنين المبكرة في الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans. تستخدم الطريقة سلالات معدلة وراثيًا مع بروتينات مضيئة لملاحظة الديناميات تحت الخلوية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- علم الأجنة
- علم الخلايا
الخلفية
- فهم تطور الجنين المبكر أمر بالغ الأهمية لبيولوجيا التطور.
- التصنيف الفلوري يسمح بتصوير العمليات الخلوية في الوقت الحقيقي.
- يعمل Caenorhabditis elegans ككائن نموذجي نظرًا لبساطته وشفافيته.
- يوفر التصوير المجهري بتقنية التقاط اللقطات رؤى حول الحركات الخلوية أثناء التطور.
هدف الدراسة
- لتسجيل الأحداث تحت الخلوية أثناء تطور الجنين المبكر.
- لتصوير ديناميات العضيات والحويصلات في الأجنة النامية.
- لتعزيز فهم التحركات الليزوزومية والحويصلية في التطور المبكر.
الطرق المستخدمة
- حقن صبغة مضيئة في غدد الدودة البالغة.
- التصوير بتقنية التقاط اللقطات باستخدام التصوير المجهري بالمسح الضوئي.
- إعداد السلالات المعدلة وراثيًا التي تعبر عن البروتينات المضيئة.
- مراقبة الأجنة في مراحل تطور مختلفة.
النتائج الرئيسية
- التصوير الناجح لديناميات الحمض النووي والعضيات خلال تطور الجنين المبكر.
- تحديد المراحل الرئيسية في تطور الجنين، بما في ذلك هجرة النوى الأولية و الانقسام الخلوي.
- رؤى حول سلوك الليزوزومات والحويصلات الموسومة خلال التطور المبكر.
- العرض الفعال لتقنيات التصوير المجهري بتقنية التقاط اللقطات في الأجنة الحية.
الاستنتاجات
- توفر الدراسة بروتوكولًا قيمًا لملاحظة تطور الجنين في C. elegans.
- تقنيات التصنيف الفلوري فعالة لتتبع العمليات الخلوية.
- تساهم النتائج في الفهم الأوسع لبيولوجيا التطور.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
High-resolution time-lapse microscopy in Caenorhabditis elegans enables direct visualization of subcellular dynamics during early embryogenesis, supporting mechanistic de-risking in discovery-stage research. This approach provides predictive confidence for target validation and pathway interrogation by allowing real-time tracking of organelle and protein localization. The methodology is strategically positioned for early discovery and assay development pipelines where functional validation and quantitative imaging are critical.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of protein and organelle dynamics in a genetically tractable model.
- Supports functional target validation by visualizing subcellular events in real time.
- Facilitates mechanistic de-risking through quantitative imaging of developmental processes.
- Provides predictive confidence for pathway and target interrogation in early discovery.
Screening & Assay Development
- Establishes validated imaging assays for quantifying protein localization and organelle behavior.
- Supports reproducible and standardized workflows for fluorescently tagged protein analysis.
- Enables preparation of robust biological systems for downstream screening applications.
- Delivers quantitative outputs suitable for comparative analysis across experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanistic studies by modeling conserved developmental pathways.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation via quantitative imaging readouts.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by clarifying subcellular mechanisms in vivo.
- Offers predictive de-risking for translational biomarker identification when supported by imaging data.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging methodology integrates into the early discovery-to-lead identification continuum, enabling hypothesis testing and pathway clarification in live embryos.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of protein and organelle dynamics during embryogenesis.
- Screening: Provides standardized, reproducible imaging assays for quantitative analysis of fluorescently labeled targets.
- Analytics: Delivers high-content imaging data for statistical comparison of developmental phenotypes.
- Translational Research: Bridges mechanistic insights from model systems to preclinical validation when imaging outputs align with disease pathways.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for diverse protein and organelle tracking studies in early development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows and enhances reproducibility across experiments.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by clarifying early developmental mechanisms.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and pathways for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and microinjection techniques.
- Demands access to advanced imaging instrumentation and fluorescent labeling reagents.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and data analysis workflows.
- May require adaptation for different model systems or protein targets.
- Photobleaching and embryo viability are practical limitations that must be managed during imaging.
