Bromodeoxyuridine (BrdU) التوسيم والفرز وبعد الإسفار خلية المنشط للتحديد ، ثقافة مستقلة عن العضوية الذائبة الكربون المهينة العوالق البكتيرية

تتوسط الميكروبات تحلل العديد من ركائز الكربون العضوي المذاب أو مركبات DOC، كما هو الحال في البيئات المائية. ولفهم دور الميكروبات في تحول DOC بشكل كامل، من الضروري تحديد تصنيفها ووظيفتها في آن واحد. يوضح هذا الفيديو إجراءً للتحديد التصنيفي للبكتيريا حرة المعيشة أو العوالق البكتيرية التي تحول أحواضاً محددة من DOC في البيئات المائية.

يتم معالجة عينات المياه التي جُمعت من بيئة اختبار وتحضينها مع مركب مستهدف ومركب برومو ديوكسي يوريدين، BRDU، الذي يندمج في الحمض النووي DNA المُصنّع حديثاً وفي الخلايا التي تنمو بنشاط. بعد ذلك، يتم وسم العوالق البكتيرية الموّسمة بـ BRDU باستخدام أجسام مضادة لـ BRDU مقترنة بـ ZI. ثم تُعزل العوالق البكتيرية ذات المستويات العالية من وسم BRDU عن طريق فرز الخلايا المنشط بالفلورة.

يتم بعد ذلك استخلاص DNA من الخلايا المفروزة، ويجرى التعريف التصنيفي بناءً على نتائج تحليل جين 16 s ribosomal RNA باستخدام تقنية PCR. مرحباً، اسمي ستيفن روبنز من مختبر الدكتور تشين ماو في قسم العلوم البيولوجية بجامعة كينت ستيت. سأعرض لكم اليوم، أنا ولـو، طريقة مستقلة عن الاستنبات للتعريف بالعوالق البكتيرية التي تحلل DOC في البيئات المائية.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل تعديلات المغذيات المتبوعة بتحليل الحمض النووي DNA للمجتمع البكتيري، في أنها تركز التحليل على البكتيريا شديدة النشاط وتستبعد الخلايا الخاملة وبطيئة النمو. نوضح هنا كيفية تحديد البكتيريا العالقة التي تستخدم مركباً واحداً محدداً من الكربون العضوي المذاب DOC. كما يمكن تطبيق هذه الطريقة أيضاً لدراسة البكتيريا العالقة التي تستخدم مركباً واحداً آخر من DOC أو مجموعة من المركبات العضوية المذابة مثل الإفرازات الطحلبية.

لذا، دعونا نحصل على بعض عينات المياه ونبدأ. قبل تحليل عينات المياه للبحث عن العوالق البكتيرية المفككة للكربون العضوي الذائب (DOC)، يجب معالجة عينات المياه بشكل مناسب. تم جمع العينات الموضحة هنا من ساحل جورجيا لإزالة الجسيمات الكبيرة والشوائب من عينة المياه.

استخدم مضخة تمعجية لنقل الماء من قارورة التجميع إلى وحدة ترشيح تحتوي على مرشح بمسام حجمها 1 micrometer. بعد ذلك، انقل حصصاً قدرها 36 milliliter من الرشاحة إلى ثلاثة أنابيب بولي بروبيلين معقمة سعة 50 milliliter، بحيث يحتوي كل أنبوب على 4 milliliter من محلول 10% Paraform aldehyde المحضر حديثاً. قم بالتحضين لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة للحفاظ على الخلايا بعد عملية التحضين.

صُبَّ الماء في برج الترشيح لوحدة ترشيح زجاجية مفرغة تحتوي على مرشحات غشائية بيضاء بمسام حجمها 0.22 micrometer، ثم طبّق التخلخل لسحب المحلول من خلالها. اغسل المرشح بتمرير 10 milliliters من PBS عبر المرشح المفرغ. ضع ملصقات على المرشحات باعتبارها ضوابط سلبية واحفظها في درجة حرارة minus 20 degrees Celsius.

لإنشاء نظام بيئي تجريبي أو نموذج مصغر، ابدأ بملء ست دوارق زجاجية سعة لتر واحد، مغسولة مسبقاً، بـ 800 milliliters من عينة المياه المفلترة مسبقاً. أضف BRDU إلى كل نموذج مصغر ليصل إلى تركيز نهائي قدره 10 micromolar. قم بتدوير الدوارق بسرعة يدوياً للمزج.

سيتم تحليل كل عينة في ثلاث مكررات. لذا، أضف مركب الكربون العضوي المذاب (DOC) النموذجي إلى ثلاثة من النماذج المصغرة. هنا، يتم إضافة الـ reine إلى النماذج المصغرة بتركيز نهائي قدره 100 nanomolar.

ثم أضف محلول PBS المعقم إلى النماذج المصغرة الثلاثة الأخرى؛ حيث ستعمل هذه النماذج كضوابط خالية من DOC. ضع جميع النماذج المصغرة في حاضنة هزازة بسرعة 100 RPM في الظلام عند درجة حرارة الموقع الأصلية، وهي 25 degrees Celsius. يتم ذلك عند النقاط الزمنية 0 و 8 و 16 و 24 ساعة.

اجمع 36 ملليلتر من كل نظام بيئي مصغر في أنبوب بولي بروبيلين معقم سعة 50 ملليلتر يحتوي على أربعة ملليلتر من بارافورمالدهيد طازج بتركيز 10%، ثم حضنها لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة لتثبيت الخلايا. بعد ذلك، قم بترشيح الخلايا المحفوظة عبر مرشحات غشائية بيضاء ذات حجم مسام 0.22 ميكرومتر. أضف 10 ملليلتر من PBS عبر مرشح الفراغ لغسل بقايا PFA.

انتقل فوراً إلى الكشف المناعي الموضعي (INS situ immuno detection) أو قم بتخزين المرشحات عند درجة حرارة 20- درجة مئوية لفحص دمج BRDU في العوالق البكتيرية. ابدأ بتدفئة مرشحات العينة في درجة حرارة الغرفة لإضعاف الجدار الخلوي البكتيري. ضع المرشح على وحدة ترشيح، ثم انقل 1 mL من محلول الليزوزيم بالماصة فوق المرشح لتغطية الخلايا، واحضرها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

بعد انتهاء فترة الحضنة، استخدم التفريغ الهوائي لإزالة المحلول. وبمجرد مرور المحلول عبر المرشح، اغسل الخلايا بإضافة 10 milliliters من PBS مع تطبيق التفريغ الهوائي. بعد ذلك، ولمزيد من تخليل جدار الخلية، أضف one milliliter من محلول proteinase K إلى المرشح لتغطية الخلايا.

تُحضن العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. تُغسل بمحلول PBS للحصول على طبقات مفردة من الـ DNA. يُضاف 1 mL من محلول exonuclease لتغطية الخلايا الموجودة على المرشح.

يتم التحضين عند 37 °C لمدة 30 دقيقة. وبعد انتهاء التحضين، تُغسل المرشحة عن طريق تمرير 10 mL من PBS عبر مرشحة الفراغ. بعد ذلك، يتم قص حواف المرشحة لإزالة الجزء الذي لا يحتوي على خلايا.

بعد ذلك، وعلى سطح جاف تم تنظيفه بالكحول، استخدم شفرة معقمة لتقطيع المرشح إلى ثماني قطع متساوية الحجم. هناك حاجة إلى ثماني غرف حضانة ذات سدادات إطارية لكل عينة؛ ضع ثمن المرشح في غرفة الحضانة ذات السدادة الإطارية المجمعة، بحيث يكون جانب العينة متجهًا للأعلى. وبمجرد تجميع الغرف، استخدم محاليل مجموعة Roche Intu لتكاثر الخلايا للكشف عن الخلايا المسمى بـ A-B-R-D-U في الموقع.

بمجرد اكتمال الإجراءات الثابتة، قم بإزالة قسم المرشح من غرفة التحضين ووضعه على سطح معقم، وباستخدام شفرة معقمة، قم بتقطيع قسم المرشح إلى قطع صغيرة. انقل قطع المرشح إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 mL يحتوي على 1 mL من PBS، ثم أغلق الأنبوب بإحكام وأحكم غلقه باستخدام البارافيلم. بعد ذلك، قم بتحضين الأنبوب في محضنة هزازة عند 37 °C وبسرعة 200 RPM لمدة 10 دقائق.

بعد انتهاء فترة الحضن، أحكم إغلاق الأنبوب وقم برجّه باستخدام جهاز الفورتكس (vortex) بأقصى سرعة. ولمدة خمس دقائق، انقل الطافي (SUP natant) باستخدام الماصة إلى أنبوب بولي بروبيلين معقم سعة 15 milliliter. بعد ذلك، أعد تعليق المرشح في محلول PBS وكرر خطوات الرج والحضن مرتين إضافيتين، مع إضافة الطافي في كل مرة إلى نفس أنبوب الـ 15 milliliter الخاص بكل عينة.

تُخزن الخلايا المعاد تعليقها عند درجة حرارة أربع درجات Celsius. ويجب تحليل العينة عن طريق fax في غضون يومين. وأخيراً، يتم فرز الخلايا للحصول على المجتمع الخلوي الذي يتميز بمستوى عالٍ من دمج BRDU.

هنا، يتم استخدام جهاز قياس التدفق الخلوي BD fax area والبرمجيات المقابلة له. وبمجرد فرز الخلايا، يمكن تحليل المجموعة المثرية بـ BRDU لتحديد هويتها التصنيفية. ولتضخيم جينات RNA الريبوزومي 16 s للبكتيريا التي تم فرزها عبر إجراء PCR، يتم نقل الخلايا المفروزة بواسطة الماصة إلى غشاء ترشيح من البولي كربونات أبيض بمسام حجمها 0.22، ثم يتم تشغيل مضخة التفريغ، وباستخدام شفرة معقمة، تُقص الحواف الخالية من الخلايا في المرشح.

قطّع المرشح إلى أربعة قطع متساوية الحجم لكل حالة، ثم ضع قطعة واحدة من المرشح في كل أنبوب من ثلاثة أنابيب تفاعل PCR مع توجيه الخلايا نحو الداخل. أضف 45 µL من الماء المخصص لـ PCR. اترك جزء المرشح يغمر تماماً في الماء.

بعد ذلك، أضف خرزتين من Roche illustra pure T ready to go PCR، ثم قم بالرج الدوامي لفترة وجيزة للمساعدة في إذابة الخرزات. ثم أضف ميكرولترين من كل من بادئات الجين 16 s ribosomal RNA الأمامية والعكسية.

أضف إما 1 µL من BSA للمساعدة في امتصاص مثبطات التضخيم أو 1 µL من الماء. قم بإجراء تضخيم PCR باستخدام جهاز الدورات الحرارية. يُوصى باستخدام برنامج touchdown PCR، حيث تنخفض درجة حرارة التلدين (annealing temperature) بالتتابع من 62 إلى 52 °C بمعدل درجة واحدة مئوية لكل دورة، تليها 15 دورة عند 52 °C.

تأكيد تضخيم PCR عن طريق الرحلان الكهربائي على هلام Agros بتركيز 1% مصبوغ ببروميد الإيثيديوم، ثم استئصال نواتج تضخيم PCR من الهلام وتنقيته باستخدام طقم KaiGen cayo quick gel extraction. بعد تنقية هلام PCR، يتم تجميع نواتج التضخيم الخاصة بنفس العينة معاً. وتصبح نواتج تضخيم DNA الريبوسومي 16s المنقاة الآن جاهزة لسلسلة من التحليلات الجزيئية.

جمعت العينات من موقع ساحلي في جورجيا وتمت معالجتها لدراسة البكتيريا المفككة لمادة الـ Racine وفقاً للإجراءات الموضحة في هذا الفيديو. الـ Racine هو مركب متعدد الأمينات يمكن العثور عليه في كافة البيئات البحرية، ويمكن أن يعمل كمصدر للمغذيات والطاقة للبكتيريا البحرية كما هو موضح هنا.

كشف تحليل حقائق العينات أنه بعد حضانة لمدة 24 hour، تطورت مجموعة من البكتيريا ذات مستوى أعلى من شدة فلورية FXI في microcosms المعدلة بـ Racine، وهو ما ارتبط إيجابياً بمدى دمج BRDU. وقد صُنفت هذه الخلايا على أنها خلايا ذات دمج عالٍ لـ BRDU أو HI، وكان من المتوقع أن تحتوي في الغالب على بكتيريا محللة لـ Racine. لا توجد خلايا hi.

وُجدت خلايا في عينات الضبط دون إضافة، والتي احتوت فقط على خلايا ذات مستويات منخفضة من دمج BRDU يُشار إليها باسم خلايا lii، وكان من المتوقع أن تحتوي هذه الأخيرة بشكل أساسي على بلانكتون بكتيري غير قادر على الاستخدام. صُنفت خلايا Racine HI المضافة في أنابيب منفصلة ثم جُمعت على مرشحات غشائية. وحُصل على مضاعفات جزئية لجين 16 ribosomal RNA بعد إجراء PCR للمرشح، وتم تأكيد ذلك بواسطة الرحلان الكهربائي للهلام.

بعد عملية التصنيف بالترشيح، يمكن أيضاً إجراء تضخيم تفاعلي لسلسلة البوليميراز (PCR) للجينات الوظيفية لفحص التنوع الوظيفي بين الخلايا المصنفة. لقد أوضحنا لكم للتو كيفية فصل وتحديد الخلايا البكتيرية الوظيفية في البيئة المائية فعلياً باستخدام نهج يربط بين فرز الخلايا المنشط بالفلورسنت ودمج BRDU. تذكر أن BRDU مادة سامة، لذا يجب دائماً ارتداء معطف المختبر وقفازات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.