ReAsH / فلاش الوسم وتحليل صورة البروتينات في خلايا الاستشعار Tetracysteine

الهدف العام من هذا الإجراء هو تسمية الخلايا التي تعبر عن رباعي السيستين والبروتين الموسوم بالفلورسنت مع وميض الأصباغ أو الرماد ، وتحليل النتائج كميا. يتم تحقيق ذلك عن طريق التحويل الأول ، وهو بلازميد يحمل بروتينا فلوريا والبروتين المستهدف الذي يحتوي على علامة رباعي السيستين في خط الخلية محل الاهتمام. بعد ذلك ، يتم تمييز البروتين المعبر عنه ب R أو flash ، ويتم إزالة النظام الغذائي غير المرتبط على وجه التحديد عن طريق الغسيل باستخدام BAL للتحضير للتصوير المجهري.

ثم يتم استخدام مجهر متحد البؤر لجمع صور الفلورسنت للخلايا مع الرماد أو الفلاش وقنوات البروتين الفلورسنت. أخيرا ، يتم تحليل الصور باستخدام الصورة J لتحديد ارتباط الرماد أو الفلاش بالبروتين المستهدف. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج توضح مدى ارتباط الرماد أو الفلاش بالبروتين المستهدف في الخلايا من خلال ارتباط مضان الرماد مع مضان البروتين الفلوري.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل مجرد أخذ البروتين المستهدف مع GFP ، هي أنه يمكن تتبع خاصية ثانية للبروتين ، مثل التغيير التوافقي بالإضافة إلى توطينه. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على السؤال الرئيسي في البنية التحتية للبروتين ومجال الوظيفة ، مثل أحداث التشكيل ، والتغيرات التوافقية ، وأحداث ربط LI التي تغير قدرة TAC على حظر الرماد أو الوميض. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما أردنا تقييم مدى تشكل تعدد الزوجات دون المجهري الصغير في هنتنغتون في الخلايا.

العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم خطوة تحليل البيانات لأنها معقدة تقنيا مما يدل على الإجراءات التجريبية. من الأول إلى الثالث ستكون ياسمين رانسون ، مساعدة باحثة من مختبرنا ، توضح تحليل البيانات. الخطوة الرابعة ستكون Sevki GaN ، طالب دراسات عليا من مختبرنا باستخدام طرق زراعة الخلايا القياسية لخط اهتمامك الخلوي وشريحة تصوير الخلايا الحية الجاهزة للتعداد.

قم بإعداد ثقافة لخلايا الالتصاق بنقل البلازميد الخاص بك الذي يحتوي على جين علامة TC المعني. وفقا لطريقة التعدي المختارة ، من المهم أن يكون لديك ضوابط إيجابية وسلبية لتقييم مدى الارتباط المحدد بعلامات TC ، وكذلك لتقييم تدفق التبييض للطلاقة بين القنوات عند جمع الصور المجهرية متحدة البؤر. لذلك ، بالنسبة لللونين ، تأكد من تحضير العينات لألوان مفردة ، إما بروتين الفلورسنت بمفرده وإذا أمكن ، بروتين T ctech مرتبط باللحم أو مقابل

ذلك بدون بروتين الفلورسنت. بعد يوم إلى يومين من التعدي ، اشطف الخلايا برفق ب 300 ميكرولتر من محلول ملح توازن هانك قبل الحرب أو HBSS ، وقم بإعداد HBSS الدافئ الطازج مع 10 ميكرومولار ، واحد ، اثنان ، وآخرون إيثان ديا ثيول أو EDT وميض ميكرومولار واحد أو رماد. وبعد إزالة HBSS من الخلايا ، استبدل برفق ب 300 ميكرولتر من وسط الرماد يحتضن لمدة 30 دقيقة بالضبط عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الأنسجة.

في تجربتنا ، تزيد أوقات الحضانة الأطول بشكل كبير من تألق الخلفية. قم بشفط محلول الملصقات برفق من الخلايا واستبدله ب 300 ميكرولتر من HBSS الدافئ مسبقا مع 250 ميكرومولار ، أو اثنين من ثلاثة ثنائيات ، أو غطاء بروبانول ، أو BAL لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. قم بإزالة محلول الغسيل عن طريق الشفط اللطيف واستبدله ب 300 ميكرولتر من HBSS الدافئ.

بعد هذا الغسيل ، يمكن تثبيت الخلايا بارتفاع الطفيلي ، على الرغم من أننا وجدنا أن هذا يزيد من التألق الساخر غير المحدد. ومن ثم ، فإننا عادة ما نصور الخلايا تعيش في درجة حرارة الغرفة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن تثبيت الخلايا قبل وضع العلامات يمنع ارتباط الصبغة الثنائية.

لبدء تصوير الخلايا على المجهر متحد البؤر ، قم بإعداد معلمات لتصوير الفلوروفورات الفردية وتأكد من وجود نزيف ضئيل بين القنوات. بعد ذلك ، اضبط إعدادات مضاعف الصور بحيث لا يشبع الحد الأقصى للتألق في العينة الكاشف. بمجرد تحديد أفضل إعدادات التصوير، لا تقم بتغيير أي منها بين العينات.

استخدم معدل مسح ضوئي يبلغ 200 هرتز ، واجمع أربعة متوسطات أسطر ، واضبط قطر الثقب على وحدة منطقة واحدة. يمكن توسيع قطر الثقب إذا كانت الإشارة إلى الضوضاء مشكلة. ومع ذلك ، قد يؤدي هذا إلى فقدان بعض دقة التصوير.

اجمع الصور متحدة البؤر بتنسيق 12 بت أو أعلى إن أمكن. تعظيم جودة التحليل الكمي للبيانات. اجمع الصور لقناة البروتين الفلوري وأيضا لقناة قالب ترسانة BI لجميع العينات.

لتحليل البيانات ، استخدم برنامج Image J مع المكونات الإضافية التالية. إذا كنت تستخدم إصدارا من Image J أقدم من الإصدار 1.32 C، فانقر فوق الخيارات التالية. لتمكين فتح صور متعددة في وقت واحد ، قم بتحرير خيارات إدخال إخراج الشرطة المائلة ، انقر فوق المربع لاستخدام منتقي الملفات j لفتح مشاركة الشرطة المائلة.

انقر فوق موافق. افتح الصور ذات الاهتمام. ستحدد الصورة J تلقائيا الحد الأقصى والحد الأدنى لشدة البكسل التي يتم عرضها على الشاشة لكل صورة على حدة، لأن الصور المختلفة سيكون لها شدة بكسل مختلفة.

هذا يعني أن الصور المعروضة لا يمكن مقارنتها كما تم عرضها. للتأكد من أن الصور المفتوحة كلها على نفس المقياس ، حدد فعليا شدة البكسل العلوية والسفلية المراد عرضها. لتعيين هذه القيم، اختر صورة، واضبط تباين الشرطة المائلة للسطوع.

انقر فوق تعيين ، وحدد الحد الأدنى والحد الأقصى للقيم المعروضة. ثم اختر نشر لجميع الصور المفتوحة وانقر فوق موافق. بدلا من ذلك ، ضع جميع الصور لقناة معينة معا في ملف واحد أو مكدس.

ستقوم الصورة J بعد ذلك بضبط جميع الصور تلقائيا على نفس المقياس. للقيام بذلك ، اختر صور مكدسات الصور لتكديسها ، وأدخل اسما مشتركا لكل ملف واختر العناوين المستخدمة كتسميات. انقر فوق موافق.

قم بتحويل جميع الصور المفتوحة إلى ثمانية بت للتحليل. باختيار نوع الصورة ثمانية بت، سيؤدي ذلك إلى إعادة قياس النطاق المعروض إلى فاصل زمني من صفر إلى 255. من المهم عدم الحفظ أكثر من التنسيق الأصلي 12 بت أو أعلى لأن هذا سيفقد محتوى المعلومات.

احفظ نسخة في مجلد جديد يسمى ثمانية بت تم تحويله باستخدام خيار الحفظ كخيار. تتمثل إحدى طرق فحص مدى ربط القالب ثنائي العروج في صورة كاملة في إجراء مخطط ارتباط شدة البكسل. هذا الرسم لكل قيمة بكسل في قناة واحدة بالنسبة لقيمة البكسل المقابلة في قناة ثانية.

وبالتالي ، فإن موضع البكسل المرتفع في مضان GFP سيكون أيضا مرتفعا في مضان الرماد إذا كان هناك ارتباط عالي. لتحليل الارتباط المشترك للبكسل ، تأكد من فتح صور REA و GFP ثمانية بت في الصورة J.التالي ، افتح المكون الإضافي لارتباط الصور عن طريق اختيار رابط الصور الإضافي. قم بتعيين ملفات الصور للصورة الأولى والصورة الثانية.

ثم انقر فوق موافق. قد لا تعرض المكدس الناتج أي معلومات مفصلة. هذا طبيعي.

احفظ المكدس في مجلد جديد يسمى المخططات المبعثرة وأعطه نفس اسم الملف مثل العينة التي يشير إليها. على سبيل المثال ، مؤامرة ارتباط الرماد GFP. لعرض البيانات، اختر أحد الخيارين.

أولا، قم بتحويل البيانات بحيث تكون تنسيق سجل عن طريق اختيار سجل العمليات التلقائي. ثم لإعادة قياس البيانات بصريا ، انقر فوق الصورة وضبط السطوع والتنسيق والتباين المائل وحدد تلقائي. ثانيا، أعد قياس البيانات بشكل مرئي لإظهار القيم المنخفضة فقط وعرض البيانات باستخدام جدول بحث خاص أو جدول بحث لإنشاء جدول بحث مخصص

انقر فوق جدول البحث لتحرير لون الصورة للحصول على جدول بحث بسيط للغاية. انقر فوق البكسل الأيسر العلوي واختر اللون الأسود. ثم حدد البكسل التالي على اليمين واختر اللون الأحمر.

بعد ذلك ، انقر فوق البكسل الثالث ، وأثناء الضغط على زر الماوس ، اسحب التحديد إلى البكسل الأيمن السفلي. حدد اللون الأحمر ، وانقر فوق موافق ، ثم حدد اللون الأبيض وانقر فوق موافق. حدد نطاق تباين الشرطة المائلة للسطوع من صفر إلى 255 كما هو موضح سابقا لقفل الصورة إلى تلك الموضحة على الشاشة.

قم بتحويله إلى تنسيق RGB لنسخ الصور ولصقها في برامج أخرى. أولا ، افتح الصور ثمانية بت أو 16 بت كما هو موضح سابقا. قم بتعيين نظام ألوان LUT لصور GFP.

قم بتعيين جدول البحث الأخضر بالنقر فوق الصورة. ابحث عن الجداول باللون الأخضر. أخيرا ، حدد الصورة المراد نسخها ونسخها إلى الحافظة باختيار تحرير النسخة إلى النظام ، يوضح هذا الشكل نتيجة نموذجية لجورب كيناز المدمجة ، و GFP وعلامة TC التي تم تلطيخها لمدة 30 دقيقة.

مع وجود الرماد في خلايا HEC 2 9 3 ، يبدو أن ASH يرتبط بكفاءة بالبروتين المستهدف الذي يحمل علامة TC ذات تقارب عال. في المقابل ، يوضح هذا الشكل عينة التحكم المقابلة ل SARK المدمجة في GFP ، ولكنها تفتقر إلى علامة TC ، وهو أمر ضروري للتحقق من خصوصية علامة TC ومستوى تلطيخ الخلفية. تظهر هذه النتيجة أن الرطوبة النسبية ليس لها تفاعل مع البروتين المستهدف ، وتفتقر إلى علامة TC ، مما يشير إلى خصوصية علامة TC لربط SSH.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر عدم السماح للخلايا بأن تكون ملتقية وهادئة ، لأن هذا سيؤثر على ارتباط V في الخلايا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحليل بياناتك ببساطة من الناحية الكمية ، ويمكنك تحسين هذه الطرق لتطوير IUTS الفريد الخاص بك لتصور البيانات.