الشلل البكتيرية للتصوير بواسطة الفحص المجهري القوة الذرية

يستخدم مجهر القوة الذرية (AFM) السبر الميكانيكي للسطح لتوليد صور عالية الدقة دون الحاجة إلى معالجة العينة كيميائيًا. في هذا الفيديو، يتم تثبيت البكتيريا على ميكا مطلية بالجيلاتين وتصويرها في بيئة سائلة باستخدام مجهر AFM. أولاً، يتم قطع مربعات من الميكا لتناسب منصة مجهر AFM، ثم تُزال الطبقة العلوية من الميكا وتُطلى مربعات الميكا بالجيلاتين.

بعد ذلك، توضع قطرة من المعلق البكتيري على الميكا المطلية بالجيلاتين ويتم نشرها. وباستخدام رأس ماصة، تُحضن العينات لمدة 10 minutes. ثم تُغسل البكتيريا غير المرتبطة من على السطح.

توضع العينة في خلية مجهر القوة الذرية (AFM) الرطبة ويتم تصويرها للحصول على صور عالية الدقة للبكتيريا الحية. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل التثبيت باستخدام مرشحات ISO المسامية، في إمكانية تثبيت البكتيريا العصوية والكروية على حد سواء بشكل موثوق. بالإضافة إلى ذلك، تكون نسبة أكبر من سطح الخلية متاحة لمسبار الـ AFM.

تكمن الميزة الرئيسية لمجهر القوة الذرية مقارنة بأنواع المجاهر الأخرى في إمكانية إجراء دراسات على خلية واحدة، حيث يمكن من خلالها استقصاء مورفولوجيا الخلية، وتكوين الحاجز، وانقسام السيتوبلازم. وقد يواجه المبتدئون في هذه الطريقة بعض الصعوبات لأنهم يميلون إلى استخدام جيلاتين لم يثبتت كفاءته في تثبيت البكتيريا، أو استخدام بكتيريا نمت في أوساط غذائية معقدة تتنافس مكوناتها مع التصاق البكتيريا بسطح الجيلاتين. وقد استلهمنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة من تجارب أجريت في السبعينيات حيث تم تثبيت البكتيريا.

شرائح زجاجية مطلية بالجيلاتين للتجارب التي تستخدم المجهر الضوئي والتصوير الشعاعي الذاتي. في هذا العرض التوضيحي، يتم تثبيت البكتيريا الحية سالبة الجرام من أجل التصوير باستخدام AFM، ولكن هذه الطريقة قابلة للتطبيق أيضاً على البكتيريا موجبة الجرام. لتحضير MICA، ابدأ بقصها باستخدام المقص لتناسب منصة مجهر AFM وتستوعب خلية AFM الرطبة.

بعد ذلك، ضع شريطاً لاصقاً على سطح الميكا (MICA) ثم انزعه لتقشير الطبقة الخارجية من قطعة الميكا المقطوعة. استمر في إزالة الطبقة الخارجية من كلا الجانبين حتى تتبقى فقط الطبقات الملساء غير المكسورة. لتحضير محلول الجيلاتين، أضف 100 milliliters من الماء المقطر إلى زجاجة مختبر وسخنه في الميكروويف.

عندما يبدأ الماء في الغليان، أخرجه من الميكروويف، وأضف 0.5 grams من الجيلاتين وقم برج الزجاجة بلطف حتى يذوب الجيلاتين. لاحظ أن الجيلاتين البقري لا يعمل بشكل جيد في هذا الإجراء، لذا يُوصى باستخدام الجيلاتين الخنزيري.

ضع الزجاجة على سطح المختبر واتركها تبرد حتى تصل درجة حرارتها إلى 60 إلى 70 درجة Celsius. بعد ذلك، صب كمية كافية من محلول الجيلاتين في كؤاس صغيرة لضمان إمكانية غمر قطعة MICA بالكامل باستخدام الملقط. اغمر مربع MICA في محلول الجيلاتين الدافئ ثم اسحبه بسرعة على الفور.

ضع شريحة MICA على حافتها فوق منشفة ورقية مائلة للاستناد إلى حامل جهاز طرد مركزي دقيق لتجف في الهواء المحيط طوال الليل. يمكن استخدام شرائح MICA المطلية بالجيلاتين لمدة أسبوعين على الأقل. أما إذا كانت شرائح MICA المطلية بالجيلاتين لن تُستخدم لبضعة أسابيع.

ضعه على ورق ترشيح في طبق بتري مغطى واحفظه في درجة حرارة الغرفة. يمكن الاحتفاظ بفائض محلول الجيلاتين مبرداً واستخدامه لمدة شهر تقريباً عن طريق إعادة تسخين المحلول المخزون إلى درجة حرارة تتراوح بين 60 و 70 °C، مع ضرورة توخي الحذر لضمان عدم غليان الجيلاتين أثناء عملية إعادة التسخين.

قبل تثبيت البكتيريا على ميكا (MICA) المغطاة بالجيلاتين، تأكد من أن التركيز البكتيري كافٍ. استخدم مقياس الطيف الضوئي (spectrophotometer) للحصول على قراءة الكثافة الضوئية لعينة البكتيريا عند 600 نانومتر. وتعد الكثافة الضوئية (OD) من 0.5 إلى 1 هي القيمة المثلى.

بعد ذلك، انقل 1 mL من المزرعة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق وقم بإجراء الطرد المركزي لترسيب العينة. استخدم ماصة لإزالة السائل الطافي، ثم اغسل الراسب في 1 mL من الماء منزوع الأيونات المفلتر أو المحلول المنظم. قم بالسحب والضخ بلطف باستخدام الماصة لإعادة التعليق.

قم بتعليق الراسب عن طريق الطرد المركزي ثم أعد تعليق الراسب فوراً في 500 µL من المياه منزوعة الأيونات فائقة النقاء (nanopure)، ويجب أن يكون المعلق البكتيري عكراً بشكل مرئي لضمان وجود تركيز كافٍ من الخلايا من أجل التصوير المجهري الفلوري (FM imaging).

إذا كانت هناك مخاوف بشأن الصدمة الأسموزية، يمكن إضافة سكروز بتركيز 0.25 molar إلى محلول التصوير. لقد قمت بإعادة تعليق هذه البكتيريا في الماء، ولكن لا تتردد في تجربة سوائل أخرى. على سبيل المثال، لقد أجرينا ذلك باستخدام 0.25% sucrose، لذا جرب سوائل أخرى لترى ما إذا كانت ستعمل بنفس الكفاءة.

قم بتجهيز شريحتين لكل عينة. وباستخدام ماصة دقيقة، أضف من 10 إلى 20 µL من معلق الخلايا إلى السطح المطلي بالجيلاتين. ثم، ولضمان توفير مساحة تغطية كافية للتصوير المجهري الفلوري (FM imaging)، استخدم طرف الماصة الدقيقة لتوزيع القطرة في الاتجاهين X و Y.

مع مراعاة عدم لمس سطح الجيلاتين بطرف الماصة، يتم تحضين العينة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، تُغسل العينة بتيار من الماء، ويُزال السائل الزائد عن العينة عن طريق لمس حافة العينة بمنشفة ورقية أو ورقة ترشيح. تُجفف إحدى الشرائح بسرعة باستخدام نفث من غاز النيتروجين.

ثم قم بفحص الشريحة بصرياً؛ حيث تشير البقعة المعتمة إلى عدم إزالة البكتيريا في خطوة الغسيل. أما الشريحة الأخرى، والتي ستُستخدم الآن للتصوير، فيجب عدم تركها لتجف.

ضع العينة في منصة الرطوبة الخاصة بمجهر القوة الذرية (AFM) وثبتها باستخدام المشابك، ثم أضف الماء إلى منصة الرطوبة باستخدام ماصة دقيقة. ومن الأفضل تجهيز مجهر القوة الذرية قبل البدء بالتصوير في السائل. تأكد من وضع الكابول المخصص للتصوير في السائل في مجهر القوة الذرية ومحاذاته مع الليزر.

باشر عملية التصوير باستخدام مجهر القوة الذرية من طراز pico plus، والمجهز برأس مسح بحجم 100 micron ومجسات vico من نتريد السيليكون ذات ثوابت نابض اسمية تتراوح من 0.01 إلى 0.1 nano newton per nanometer. بمجرد تحضير المجهر، أدخل ماسح FM والمنصة في المجهر. عادةً، نبدأ بسرعة تصوير تتراوح من 0.5 lines per second وصولاً إلى one line per second، ويتم ضبط الدقة من 1 28 data points per line إلى 512.

اضبط الجهاز لجمع الصور باستخدام 128 إلى 512 بكسل لكل خط. قم بالمسح بسرعة مسح تتراوح من 0.5 إلى خط واحد في الثانية. بعد ذلك، وإذا لزم الأمر، قم بتعديل نقطة الضبط والمكاسب (gains) في وضع A FM للحصول على صور مثالية.

أخيراً، قم بجمع الصور. تم تثبيت بكتيريا E coli على MICA مغطاة بالجيلاتين كما هو موضح في هذا الفيديو، ثم تم تصويرها في 0.005 molar PVS. باستخدام هذه الطريقة.

تظهر السواطير بوضوح في الصورة التي تم جمعها، وتكون أسطح الخلايا ملساء، ولا تظهر عليها أي علامات للجفاف. وبالمقارنة، فإن الصور التي تم التقاطها لنفس بكتيريا e coli في الهواء كما هو موضح هنا، غالباً ما تظهر هياكل لا تُرى في السائل. وفي هذه الحالة، تظهر الخلايا بمظهر مجعد نتيجة للجفاف، ويمكن رؤية الزوائد البكتيرية مثل FIA.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير عينات بكتيرية للتصوير باستخدام مجهر القوة الذرية (FM) في بيئة سائلة. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون ساعة واحدة تقريبًا إذا كانت الأسطح الدقيقة المطلية بالجيلاتين قد تم تحضيرها مسبقًا. عند محاولة إجراء هذه العملية، من المهم اختيار الجيلاتين الصحيح والوصول إلى تركيز مناسب من البكتيريا باتباع هذا الإجراء.

يمكن إجراء قياسات أخرى، مثل استخدام عارضة FN كأداة لاستشعار القوة للحفاظ على قياسات القوة على الأسطح البكتيرية. كما يمكن ربط جزيئات مسبار محددة بطرف A FM للتفاعل مع أهداف محددة على السطح البكتيري لتحديد وقياس قوى التفاعل. وبشكل عام، لا تنسَ أنه إذا كنت تعمل مع بكتيريا ممرضة، فيجب اتخاذ الاحتياطات دائمًا عند العمل بهذه الطريقة.