الكشف عن الفيروسات المعدية التي جمعت من الحقل عن طريق البعوض فيرو خلية الفحص الثقافة

الهدف العام من هذا الإجراء هو فحص البعوض الذي تم جمعه من الميدان للكشف عن العدوى الفيروسية باستخدام مقايسة زراعة خلايا Vero. أولاً، يتم فرز البعوض الذي تم جمعه من الميدان وفقاً للأنواع. ثم يتم تجنيس البعوض باستخدام مطحنة خلط.

بمجرد تحضير متجانسات البعوض، يتم استزراع خلايا Vero استعداداً للاختبار الفيروسي، ثم يتم تلقيح كل مستنبت من خلايا Vero بمتجانس واحد من البعوض ووضعه على جهاز هزاز لمدة خمس دقائق، ثم يُحضن عند 37 درجة مئوية للسماح للفيروسات بالتكاثر. وفي النهاية، تُفحص المستنبتات بصرياً للبحث عن أدلة على التأثيرات المرضية الخلوية الناجمة عن الفيروسات. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل R-T-P-C-R في أنها تسمح بفحص البعوض للكشف عن تنوع واسع من العوامل الفيروسية التي تنمو في المزارع الخلوية.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال علم الحشرات الطبي، مثل الأدوار التي تلعبها أنواع مختلفة من البعوض في دعم نقل الفيروسات. استخدم مرفقاً من المستوى الثاني للسلامة البيولوجية لإجراء العملية التالية. ضع كيس الجمع الذي يحتوي على بعوض حي في درجة حرارة -20 °C لمدة 15 دقيقة لتخديرها.

بمجرد تخدير الحشرات، انقل الكيس إلى حاوية معزولة تحتوي على ثلج جاف وعرّض البعوض لثاني أكسيد الكربون لمدة تتراوح من دقيقة إلى ثلاث دقائق لضمان التثبيط التام. بعد ذلك، ضع البعوض على صينية مبردة مسبقاً فوق طبقة من الثلج الجاف. وباستخدام ملاقط دقيقة الطرف، حدد الحشرات الإناث وانقلها إلى أكواب بلاستيكية صغيرة.

يمكن تمييز الإناث عن الذكور من خلال فحص أجزاء الفم وقرون الاستشعار. أغلق الكؤوس بإحكام وضعها على ثلج رطب. باستخدام مجهر تشريحي ستيريو مثبت على طاولة تبريد إلكترونية ومفتاح تصنيفي.

حدد أنواع البعوض في كل مجموعة، ثم ضع البعوض من النوع نفسه في أنابيب ذات غطاء ضاغط سعة 2 mL مُصنفة تحتوي على كرة نحاسية. يمكن تجميع ما يصل إلى 50 فرداً في أنبوب واحد مع امتلائه. ضع الأنابيب في أكياس مُصنفة داخل حاوية من البوليسترين فوق الثلج الجاف.

بمجرد تحديد هوية جميع البعوض، يمكن تخزينها في درجة حرارة -80 °C حتى عملية التجانس. استخدم مرفقاً من المستوى الثالث للسلامة البيولوجية لهذا الإجراء، واعمل داخل كابينة سلامة بيولوجية من الفئة الثانية. أضف حوالي 1 mL من PBSG لكل أنبوب، وضع الأنابيب التي تحتوي على البعوض داخل خرطوشة طاحونة خلط مبردة مسبقاً.

ثبّت الكاسيت المُحمّل داخل مطحنة خلط وقم بتجانس مجموعات البعوض لمدة أربع دقائق بمعدل 25 دورة في الثانية. وبمجرد تجانس البعوض، انقل الأنابيب إلى جهاز طرد مركزي دقيق مبرد ومحكم ضد الرذاذ وقم بإجراء الطرد المركزي. يتم طرد متجانس البعوض مركزيًا بسرعة 7,000 RPM لمدة ست دقائق.

بعد عملية الطرد المركزي، يمكن تخزين الأنابيب عند درجة حرارة 80- °C حتى يتم إجراء اختبار الفيروس. قم بسكب وسط الزرع من قارورة T 1 75 تحتوي على خلايا farrow متلاحمة في دورق نفايات يحتوي على مبيض. أضف 5 mL من PBS إلى القارورة واغسل الخلايا بالتساوي قبل سكب PBS في دورق النفايات.

بعد غسل الخلايا، أضف 2.5 milliliters من tripsin EDTA واحضن القارورة عند 37 degrees Celsius و 5%CO2 لمدة خمس دقائق لفصل الخلايا. وبمجرد انفصال الخلايا، أضف خمس milliliters من MEM واستخدم الماصة لسحب الخلايا ودفعها لعدة مرات لتفكيك أي تكتلات. ثم أضف 15 milliliters أخرى من MEM.

ضع 40 دوارق T 25 على حاملين داخل كابينة السلامة البيولوجية وأزل أغطية الدوارق، مع وضعها مباشرة أمام كل دورق، وباستخدام ماصة معقمة، وزع 4 mL من MEM في كل دورق. ثم أضف 0.5 mL من خلايا vari المعلقة وأغلق الدوارق. رص الدوارق على صينية وقم بتحريكها بلطف للتأكد من أن الوسط يغطي قاع الدوارق بشكل موحد.

يتم تحضين المزارع عند درجة حرارة 37 درجة مئوية و 5%CO2 طوال الليل أو حتى تصل درجة تلاقي الخلايا إلى 80 إلى 90%. يتم إخراج 20 قارورة صغيرة من المحضنة وتسميتها برقم التسجيل المقابل لكل مجموعة من البعوض. يتم سكب معظم الوسط من كل قارورة في وعاء النفايات مع ترك كمية كافية فقط من الوسط لتغطية الطبقة الأحادية من الخلايا.

انقل 100 µL من السائل الطافي من كل متجانس للبعوض إلى القارورة المحددة بالعلامة المقابلة وأغلق القوارير بإحكام. وبمجرد نقل السوائل الطافية، ضع القوارير على جهاز هزاز مضبوط على 35 إلى 40 RRP M لمدة خمس دقائق. أعد القوارير إلى كابينة السلامة البيولوجية وأضف 4 mL من وسط النمو إلى كل منها.

أغلق الدوارق وأحضرها في حضانة عند 37 درجة Celsius و 5%CO2 لمدة تتراوح من ثلاثة إلى سبعة أيام. وبمجرد أن تصبح المزارع جاهزة للفحص، قم أولاً بفحص الوسط بصرياً؛ حيث يشير الوسط العكر إما إلى تأثيرات اعتلال خلوي ناتجة عن الفيروسات أو تلوث بميكروبات أخرى، أو كليهما. ثم افحص المزارع التي يظهر وسطها عكراً باستخدام مجهر ضوئي مقلوب.

تتسبب الفيروسات عادةً في تشوه الخلايا وانفصالها عن دوارق الزرع. في حال الكشف عن تلوث بالبكتيريا أو الخمائر أو الفطريات، أو إذا كانت المزرعة تحتوي على حطام كثيف من البعوض، أعد اختبار تجمع البعوض الأصلي بعد ترشيحه باستخدام سرنجة بمرشح 0.22 micron. قم بتوزيع واحد إلى اثنين من المليلترات من الوسط الزرعي من المزارع الإيجابية للفيروس وغير الملوثة بكائنات دقيقة أخرى في أنابيب تجميد (cryo tubes) مُلصق عليها بيانات، وذلك باستخدام تقنيات الترشيح المعقمة.

تُخزن العينات التي تحتوي على الفيروسات عند درجة حرارة 80- درجة مئوية حتى يتم تحديد هويتها، وذلك باستخدام المقايسات التشخيصية المناسبة المعتمدة في هذا الفحص. وقد تم استخلاص تسعة أنواع مختلفة من الفيروسات من أربع فصائل تصنيفية من البعوض الذي جُمع في ولاية كونيتيكت خلال فترة مراقبة مستمرة على مستوى الولاية من عام 1997 إلى عام 2010. ومن المعروف أن العديد من هذه الفيروسات، بما في ذلك فيروس التهاب الدماغ والنخاع الخيلي الشرقي وفيروس West Nile، تسبب أمراضاً بشرية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية فرز ومعالجة وفحص البعوض للكشف عن العدوى الفيروسية باستخدام مقايسة المزرعة الخلوية الفيروسية.