الفلورسنت النانوية لقياس تركيز ايون في النظم البيولوجية

الهدف العام من التجربة التالية هو تصنيع مستشعرات نانوية للصوديوم لاستخدامها في تطبيقات في المختبر (in vitro) وفي الكائن الحي (in vivo). ويتم تحقيق ذلك من خلال تحضير خليط بصري (opto mixture) يحتوي على مكونات المستشعرات للمستشعرات النانوية. وفي خطوة ثانية، يتم تعريض المادة الخافضة للتوتر السطحي للموجات فوق الصوتية في محلول مائي لضمان توزيعها بالتساوي، مما يسمح بتكوين المستشعرات النانوية عند إضافة الخليط البصري.

بعد ذلك، يُضاف الخليط البصري إلى خليط الخافض للتوتر السطحي المائي تحت تأثير الموجات فوق الصوتية لتكوين المستشعرات النانوية في المحلول. يوضح هذا الفيديو أن استجابة المستشعر قابلة للضبط. كما يمكن حقن المستشعرات مجهرياً في الخلايا العضلية القلبية، كما يمكن حقنها تحت الجلد في الفئران.

تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل صبغات المؤشرات الفلورية، في قدرتنا على ضبط المستشعرات لتتوافق مع نطاق ديناميكي يطابق البيئة الفسيولوجية، وقياس نطاق أوسع من المواد التحليلية، وإجراء قياسات نسبية للتحليل الكمي. وبشكل عام، قد يواجه الأشخاص الجدد في هذه الطريقة بعض الصعوبات، لأنه بمجرد تصنيع المستشعرات، قد يبدو إدخالها في بيئة بيولوجية أمراً شاقاً. يجب تحضير مخزونات من sodium ion four x dry sodium TFPB و chromo four three مسبقاً قبل تصنيع الـ opto وفقاً للبروتوكول المكتوب.

داخل خزانة استخلاص الغازات، اخلط جميع المواد في قارورة زجاجية سعة 1.5 milliliter. باستخدام غطاء لولبي مغطى بالتفلون، قم برج القارورة باستخدام جهاز vortex بلطف حتى يذوب الـ PVC تماماً. يجب أن يظهر المحلول باللون الأحمر.

ابدأ في تحضير المستشعرات النانوية بإضافة 100 µL من 10 mg/mL من PEG lipid إلى قارورة زجاجية سعة 4 g. بعد ذلك، أضف 4 mL من المحلول المائي المطلوب، مثل HEPES بتركيز 10 mM.

قم بتثبيت رأس جهاز السونيكاتور بعمق 7 mm داخل القارورة باستخدام رافعة مختبرية، ثم طبق قدرة سونيكة منخفضة لمدة 30 ثانية. في أنبوب سعة 0.6 mL، اخلط 50 µL من المادة الضوئية مع 50 µL من ثنائي كلورو ميثان باستخدام الماصة لضمان التجانس. بعد ذلك، ابدأ عملية سونيكة لمدة ثلاث دقائق.

مع بدء عملية سونكة (sonication)، أضف 100 µL من الخليط الضوئي عن طريق غمر طرف الماصة وتفريغ الحجم كاملاً في حقنة واحدة سريعة ومتساوية. سيتحول المحلول إلى اللون الأزرق إذا ارتفع الـ pH فوق سبعة، وفي حال عدم وجود صوديوم لإزالة الـ THF المتبقي والـ di chloro methane من المحلول. حرك طرف السونكة إلى عمق 2 mm.

مع مرور الدقائق الثلاث المتبقية، سيصبح المحلول معتماً. بمجرد اكتمال عملية السونيكة (Sonication)، اسحب محلول المستشعر النانوي (Nanosensor) إلى حقنة سعة خمسة مليليتر. ثم قم بتركيب مرشح وصُب محلول المستشعر النانوي في قارورة زجاجية ذات غطاء لولبي.

ابدأ بتحضير 10 محاليل بتركيزات صوديوم متزايدة تدريجياً لقياس حساسية المستشعر النانوي مقابلها. امزج المحاليل المخزونية للصوديوم بتركيز 0 مولار و1 مولار في أنابيب مخروطية سعة 50 milliliter. الآن، في طبق بـ 96 بئراً ذا قاع بصري، أضف 100 microliters من كل تركيز من الصوديوم إلى ثلاث آبار في عمود واحد.

ثم أضف 100 µL من المستشعرات النانوية المحضرة حديثاً إلى كل بئر، ثم ضع الطبق في مقياس فلورية الأطباق الدقيقة (microplate fluorimeter) وأدخل أطوال موجات الإثارة والانبعاث والقطع المثالية للكروموفور المستخدم. يعتمد اختيار الأطوال الموجية المقاسة على التطبيق المستخدم، حيث تتيح هذه الأطوال الموجية إجراء قياسات للديناميكيات السريعة داخل الخلايا أو تقليل الضوضاء.

للحصول على قيم alpha، اقسم نسبة الشدة عند 570 nanometers على الشدة عند 670 nanometers أو 680 nanometers. قم برسم قيم alpha مقابل لوغاريتم تركيز الصوديوم، مع تعيين لوغاريتم تركيز الصوديوم الصفري بقيمة ناقص واحد.

الآن، قم بمطابقة منحنى سيني (sigmoidal curve) مع الاستجابة، ومن خلال المنحنى، احسب تركيز الصوديوم الذي تكون عنده قيمة alpha مساوية لـ 0.5. يمثل هذا تركيز الصوديوم الذي يستجيب عنده المستشعر بشكل أمثل. باستخدام هذه المعلومات، قم بتعديل نسبة sodium iono four x sodium TFPB و chromo iono four three في الـ opto لإنشاء مستشعرات نانوية ذات تركيز صوديوم أمثل.

على سبيل المثال، منحنيات استجابة البطل لخمس مجموعات مختلفة من المستشعرات النانوية التي تمثل تركيبات بصرية مختلفة، وتتفاوت فقط في كمية الصوديوم من أربعة 10. وللتصوير داخل الخلايا، استبدل الوسط الخلوي بوسط شفاف مثل محلول Tyro وانقل الخلايا إلى غرفة التصوير. الآن، قم بملء ماصة زجاجية مسحوبة بمحلول المستشعرات النانوية المحضر في 5 mg/mL من الجلوكوز في الماء.

بعد ذلك، قم بتثبيت الماصة على مجهر تحكم دقيق (micro manipulator) ووصلها بنظام حقن يتم التحكم فيه عن طريق الضغط. أنزل الماصة فوق الخلية وصولاً إلى السيتوبلازم. قد يتطلب الأمر أحياناً النقر على حامل المجهر لاختراق الغشاء.

احقن بضع مئات من البيكولتر من محلول المستشعر النانوي ثم اسحب الماصة بسرعة. خدر فأراً عارياً من نوع CD one باستخدام الإيزوفلوران عبر غرفة التخدير. وبمجرد تخدير الفأر، ضعه في غرفة التصوير المعقمة.

بعد ذلك، املأ محقنة إنسولين معقمة مقاس 31 gauge بـ 10 µL من المستشعرات النانوية ذات KD المناسب في 10 mM PBS. تأكد من إزالة جميع الفقاعات الهوائية باستخدام الملاقط. أمسك طية صغيرة من الجلد على طول ظهر الفأر عند موقع الحقن المطلوب أثناء الإمساك بالجلد.

أدخل المحقنة في الجلد بحيث تكون الشطبة متجهة للأعلى والإبرة موازية لسطح الجلد. الآن، اسحب مكبس المحقنة للخلف للتأكد من أن الإبرة لم تخترق وعاءً دمويًا. وللتقليل من الضغط المرتد، حرك الإبرة برفق جهة اليمين واليسار لإنشاء جيب داخل الجلد.

ثم قم بحقن المستشعرات وأزل المحقنة برفق. اضغط بلطف على موقع الحقن وامسح أي محلول قد يكون قد تسرب منه. عادةً ما يتم إجراء ست حقنات متباعدة بالتساوي على طول الظهر.

في حال إجراء العملية على فئران مختلفة، استبدل الإبرة لتقليل احتمالية نقل الأمراض والتلوث الخلطي. بعد الحقن، التقط صوراً بالمجال المضيء والصور الفلورية باستخدام مجموعات مرشحات تتطابق بدقة مع طيف الإثارة والانبعاث للمستشعرات النانوية؛ حيث يقلل ذلك أيضاً من التفلور الذاتي للجلد.

تمت زراعة هذه الخلايا العضلية القلبية حديثي الولادة على شريحة غطاء زجاجية وحُقنت بمستشعرات نانوية للصوديوم. التُقطت هذه الصورة الفلورية عند طول موجي للإثارة يبلغ 639 نانومتر. وهذه صورة بالمجال المضيء لنفس الخلايا، وهذه صورة مدمجة لكلتيهما.

يحدث بعض التكتل للمستشعرات، ولكن الخلايا ذات شكل طبيعي. لقد انتشرت المستشعرات في جميع أنحاء السيتوبلازم ولا يوجد تحميل نووي. يظهر هذا التراكب لصورة الحقل المضيء والصورة الفلورية تسع حقنات مختلفة تحت الجلد من مستشعرات الصوديوم النانوية في الحيز تحت الجلد لفأر عارٍ.

بمجرد تصنيع المستشعرات النانوية، يمكن إتمام العملية في غضون دقائق إذا نُفذت بشكل صحيح، ويمكن تطبيقها في أي بحث لقياس تدفق المواد التحليلية العكسي في الوقت الفعلي. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية تحميل المستشعرات النانوية في الحيز داخل الخلوي أو تحت الجلد لإجراء قياسات كمية في بيئة بيولوجية.