البوليمرات الذاكرة شكل خلية للثقافة أحدث

الهدف العام من هذا الإجراء هو زراعة الخلايا في ركيزة ذات تضاريس تتغير بمرور الوقت. ويتم تحقيق ذلك من خلال برمجة بوليمر ذاكرة الشكل أولاً في شكل دائم يمكن استعادته. بعد ذلك، يتم برمجة بوليمر ذاكرة الشكل في شكل مؤقت تُزرع عليه الخلايا لاحقاً.

تتمثل الخطوة النهائية من الإجراء في تحفيز بوليمر ذاكرة الشكل للعودة إلى شكله الدائم عن طريق رفع درجة الحرارة، مما يؤدي في النهاية إلى الحصول على نتائج تظهر تغيراً في سلوك الخلايا من خلال المجهر الفلوري. مرحباً، اسمي بات ماثر، أنا بروفيسور في الهندسة الطبية الحيوية والكيميائية ومدير معهد سيراكيوز للمواد الحيوية هنا في جامعة سيراكيوز.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالأجهزة التجارية أو المخصصة لتمديد الخلايا في قدرتنا على تطبيق مجموعة واسعة ومتنوعة من الإجهادات المعقدة على الخلايا باستخدام نظام بوليمري واحد. اسمي جاي هندرسون، وأنا أستاذ مساعد في الهندسة الطبية الحيوية والكيميائية وعضو في معهد سيراكيوز للمواد الحيوية.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال الميكانيكا الحيوية، مثل كيفية استجابة الخلايا للتغيرات الديناميكية في بيئتها الفيزيائية. اسمي كيفن ديفيس، وأنا طالب دكتوراه في جامعة سيراكيوز بقسم الهندسة الطبية الحيوية والهندسة الكيميائية. وعلى الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى حول الميكانيكا الحيوية ثنائية الأبعاد (2D)، إلا أنه يمكن استخدامها أيضاً لأنظمة أخرى مثل السقالات ثلاثية الأبعاد (3D) متغيرة الشكل المستخدمة في هندسة الأنسجة.

قبل البدء بهذا الإجراء، قم بتجهيز غرفة معالجة مخصصة باستخدام شريحة زجاجية، وفاصل من التفلون بسمك 1 مم، ولوح من الألومنيوم. قم بتثبيت الغرفة باستخدام مشابك ربط صغيرة، ثم ابدأ بحقن NOA 63 داخل الغرفة عبر ثقب في فاصل التفلون باستخدام إبرة قياس 18. بعد ذلك، ضع الغرفة على لوح تسخين مضبوط عند 125 °C.

اترك الغرفة لتسخن حتى تصل إلى درجة حرارة منتظمة لمدة خمس دقائق بعد تسخين الغرفة. قم بمعالجة NOA 63 لمدة 20 دقيقة عن طريق وضع مصباح UV على مسافة 6.5 سنتيمتر من سطح الزجاج. أخرج NOA 63 من الغرفة بينما لا يزال دافئًا باستخدام شفرة حلاقة.

بعد ذلك، يتم إجراء المعالجة اللاحقة لبوليمر ذاكرة الشكل تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة ثلاث ساعات و40 دقيقة مباشرة على اللوح الساخن عند 125 درجة Celsius. ولتوصيف خاصية ذاكرة الشكل لـ NOA 63، يتم تحضير عينة على شكل دمبل عن طريق الكبس الحراري للفيلم المعالج باستخدام خرامة مخصصة. وأخيرًا، يتم تحميل العينة في محلل ميكانيكي ديناميكي مزود بملحق شد.

اضبط الجهاز على وضع التحكم في القوة وقم ببرمجة إجراء الاختبار وفقاً لما ورد في البروتوكول المكتوب المرفق بهذا الفيديو. وتتمثل نتيجة هذا الإجراء في الحصول على فيلم من بوليمر ذاكرة الشكل أو SMP معالج حرارياً. ضع فيلم الـ CSMP على لوح ساخن واضبط درجة الحرارة لتكون أعلى من درجة حرارة الانتقال الزجاجي من أجل تقليل معامل المرونة وتسهيل عملية القطع. لتحضير عينات فردية من فيلم الـ SMP المعالج حرارياً.

قم بقص غشاء s و p باستخدام شفرة حلاقة للحصول على حجم العينة المطلوب. يمكن تثبيت الشكل المؤقت بطرق مختلفة عديدة. هنا، يتم استخدام مكبس هيدروليكي مكتبي مزود بألواح يمكن تسخينها وتبريدها لضغط تضاريس مؤقتة.

أولاً، يتم ضبط درجة حرارة الـ PLAs عند درجة حرارة أعلى من الـ tg. وفي هذا العرض التوضيحي، تم صنع أداة نقش عن طريق معالجة الإيبوكسي على أسطوانة فينيل لإنتاج شكل مؤقت من الأخاديد المتوازية. يمكن صنع أداة النقش من مواد أخرى وبتضاريس مختلفة، ولكن يجب أن تكون أكثر صلابة من الـ NOA 63.

عند درجة حرارة النقش، ضع عينات s و p بحيث يكون الوجه لأسفل على أداة النقش. ثم ضع العينات وأداة النقش داخل المكبس. قم بتطبيق حمل مسبق يبلغ حوالي 100 kilo pascals لضمان التلامس بين ألواح PLA المسخنة والعينات، والثبات لمدة خمس دقائق تقريبًا للسماح للعينات بالوصول إلى درجة حرارة موحدة.

بمجرد الوصول إلى درجة حرارة منتظمة، قم بتطبيق ضغط يتراوح من 1 إلى 6 megapascals على العينات والثبات لمدة دقيقة واحدة. سوف يتكسر SMP. في حالة تطبيق إجهاد أكبر.

قم بتطبيق إجهادات أقل لإحداث تضاريس ذات سعات أصغر. بعد تطبيق الضغط، خفّض درجة الحرارة إلى ما دون TG باستخدام قدرة التبريد المائي لصفائح المكبس. عندما تصبح درجة الحرارة أقل من tg، قم بإزالة القوة المطبقة قبل البدء في تجربة زراعة الخلايا النشطة.

يُستخدم ضوء الأشعة فوق البنفسجية (UV) في كابينة السلامة البيولوجية لتعقيم العينات. رتّب العينات بحيث يكون الوجه لأسفل في أطباق معقمة بدون أغطية، وقم بتشغيل ضوء UV لمدة ست ساعات. بعد ذلك، انقل العينات إلى أطباق معقمة جديدة بحيث يكون الوجه لأعلى.

قم بتشغيل الأشعة فوق البنفسجية (UV) لمدة ست ساعات إضافية. يجب موازنة العينات حتى تصل إلى حالة مستقرة نسبياً قبل الزرع مع الخلايا. ضع العينات في طبق ميكروي يحتوي على 96 بئراً وأضف 150 µL من وسط النمو الكامل.

الوسط لكل بئر. ضع الطبق في حاضنة بدرجة حرارة 30 درجة مئوية مع 5%CO2 حتى الوصول إلى استعادة جزئية مطلوبة. في هذا العرض التوضيحي، يتم تحضين العينات لمدة 30 ساعة لإنتاج سعة كافية لمحاذاة الخلايا.

بمجرد تحقيق الاسترداد الجزئي، يمكن زراعة العينات بالخلايا. ضع العينات في طبق 96 بئراً جديداً. ثم أضف 150 µL من محلول الخلايا إلى كل عينة هنا، C3 H 10 t and a half.

يتم استخدام معظم الخلايا الليفية الجنينية بتركيز 20,000 خلية لكل ملليلتر. وللحصول على خلايا معزولة، تُترك الخلايا لتلتصق وتنتشر على التضاريس المؤقتة عن طريق التحضين عند 30 درجة Celsius لمدة 9.5 ساعة. بعد ذلك، يتم فحص مورفولوجيا الخلايا قبل الانتقال عن طريق إزالة العينات وإجراء الصبغ والتصوير الفلوري لها.

تظهر هذه المادة فلورة ذاتية عبر معظم نطاق الأشعة فوق البنفسجية والمدى المرئي، لذا يوصى باستخدام الفلوروفورات في الطرف الأحمر البعيد من الطيف، مثل Alexa Fluor 647، لتقليل الخلفية. ولتنشيط العينات لاستعادة حيويتها، انقل الطبق إلى حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة Celsius واستمر في الزرع لمدة 19 ساعة؛ حيث يسمح ذلك للمادة بالتعافي وللخلايا بتكييف شكلها المورفولوجي مع التضاريس الجديدة. وبعد الحضانة، ضع الصبغات المناسبة مثل phalloidin لتصوير الأكتين الخيطي.

كخطوة نهائية، يمكن تصوير الخلايا على التضاريس الجديدة؛ الموضح هنا هو تأثير ذاكرة الشكل أحادي الاتجاه للكتلة لعملية تصلب واحدة من NOA 63. كُررت العملية ثلاث مرات، حيث تشير النجمة إلى بداية التصلب التجريبي. يُعد NOA 63 مادة صلبة زجاجية شفافة تتميز بخصائص ممتازة لذاكرة الشكل.

في هذه الحالة، تمت معالجة المادة وأظهرت درجة حرارة انتقال زجاجي (TG) منتظمة بلغت 51.1 °C كما تم تحديدها من بداية انخفاض معامل التخزين. ويحدث الانخفاض في الانفعال الملاحظ هنا عند قيمة tg المقاسة. وقد تم تثبيت نسبة كبيرة من الانفعال المطبق البالغ 4.7% بعد تفريغ الحمل عند 20 °C، وهو ما يقابل نسبة تثبيت بلغت 89.3%. ثم استعيد الانفعال المثبت بنسبة 84.4% في نطاق درجات حرارة صغير نسبيًا أثناء التسخين.

لم يظهر أداء ذاكرة الشكل أي تدهور حتى ثلاث دورات، كما يتضح من تتبع جميع المنحنيات للمسار نفسه تقريباً. وتتناقص سعة التضاريس المؤقتة بمرور الوقت عند 30 degrees Celsius خلال 30 hours. عند 30 degrees Celsius.

لقد انخفضت السعة بنسبة 50% تقريباً كما هو موضح هنا عند الزمن صفر. ثم تنخفض بنسبة 10% أخرى خلال الساعات 9.5 التالية. وعندما يتم تحفيز الاستعادة عن طريق رفع درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية، تنخفض السعة إلى 0.5% من السعة الأولية خلال 9.5 ساعة بالنسبة للمكبس المستخدم وبإجهاد كبس يبلغ 4.9 ميجا باسكال.

يتوافق هذا مع تغير وظيفي من أخاديد بحجم 13 ميكرومتر إلى سطح شبه مستوٍ. يستعيد هذا البوليمر شكله في نطاق درجة حرارة من 30 إلى 37 درجة تحت ظروف زراعة الخلايا. ويرجع ذلك إلى امتصاص الماء من وسط الزراعة، حيث يعمل الماء على تلدين البوليمر، مما يخفض tg، وهو ما يسمح بالاستعادة عند درجات حرارة أقل من TG الجاف البالغ 51 درجة.

يعد التغير في تنظيم الهيكل الخلوي على ركائز محززة مؤقتة مثالاً على سلوك خلوي يتم التحكم فيه من خلال استخدام ركائز زراعة خلوية نشطة. قبل تحفيز عملية الاستعادة، تصطف خيوط الأكتين الدقيقة على طول اتجاه الحزوز. وبعد الاستعادة عن طريق زيادة درجة الحرارة، تعيد الخيوط الدقيقة تنظيم نفسها وتصبح موجهة بشكل عشوائي.

وعلى العكس من ذلك، فإن عينات التحكم التي تحتوي على أخاديد مسطحة أو ثابتة لا تعيد تنظيم نفسها بعد زيادة درجة الحرارة. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن هندسة غرفة المعالجة، ودرجة حرارة الانتقال للبوليمر، وطريقة تثبيت الانفعال، وتركيبة البوليمر نفسه، كلها عوامل يمكن تعديلها لتحقيق الانتقال المطلوب في تجربتك الخاصة عند اتباع هذا الإجراء. ويمكن استخدام طرق أخرى، مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (real time PCR)، للإجابة على أسئلة إضافية، مثل كيفية تغير التعبير الجيني استجابةً للتحفيز الميكانيكي من الركيزة بعد تطويرها.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الميكانيكا الحيوية الخلوية لدراسة إعادة ترتيب الهيكل الخلوي وفيزياء المادة اللينة في بُعدين. نشكركم على اهتمامكم بعملنا وعلى المشاهدة.