Name: منخفضة التكلفة المرحلة الميكروسكوب البرد الخفيفة التصنيع الخفيف مربوط / مجهرية إلكترون (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: تعلم تصنيع منصة تبريد ميكروسكوبية منخفضة التكلفة لتمكين التصوير المجهرية الإلكترونية والضوئية المتزامن للعينات البيولوجية المجمدة باستخدام مواد متوفرة محلياً.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

الكتاب أود أن أشكر براندون J. زيب وكين كابلان باء لتوفير الوصول إلى سلالة الخميرة المستخدمة في هذه الدراسة. ونشكر أيضا كتاب لينين خوليو راميريز دومينغيز لتصوير بالفيديو للحصول على مساعدة. JEE يقر بدعم من المعاهد الوطنية للصحة تمويل عدد المنح 5RC1GM91755.

<ol><li>Dubochet, J., Adrian, M., Lepault, J., McDowall, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+biological+speciments%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitrified biological speciments.</a> Trends Biochem. Sci. 10, 143-146 (1985).</li>
<li>Plitzko, J. M., Rigort, A., Leis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+cryo-light+microscopy+and+cryo-electron+tomography%3A+from+cellular+territories+to+molecular+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Correlative cryo-light microscopy and cryo-electron tomography: from cellular territories to molecular landscapes.</a> Curr Opin Biotechnol. 20, 83-89 (2009).</li>
<li>Schwartz, C. L., Sarbash, V. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R., Nicastro, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-fluorescence+microscopy+facilitates+correlations+between+light+and+cryo-electron+microscopy+and+reduces+the+rate+of+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Cryo-fluorescence microscopy facilitates correlations between light and cryo-electron microscopy and reduces the rate of photobleaching.</a> J Microsc. 227, 98-109 (2007).</li>
<li>Lepper, S., Merkel, M., Sartori, A., Cyrklaff, M., Frischknecht, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+quantification+of+the+effects+of+blotting+for+correlation+of+light+and+cryo-light+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Rapid quantification of the effects of blotting for correlation of light and cryo-light microscopy images.</a> J Microsc. 238, 21-26 (2010).</li>
<li>Sartori, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+microscopy%3A+bridging+the+gap+between+fluorescence+light+microscopy+and+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Correlative microscopy: bridging the gap between fluorescence light microscopy and cryo-electron tomography.</a> J Struct Biol. 160, 135-145 (2007).</li>
<li>McDonald, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+high-pressure+freezing+preparation+techniques+for+correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+same+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues.</a> J Microsc. 235, 273-281 (2009).</li>
<li>van Driel, L. F., Valentijn, J. A., Valentijn, K. M., Koning, R. I., Koster, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+for+correlative+cryo-fluorescence+microscopy+and+cryo-electron+tomography+applied+to+whole+mitochondria+in+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tools for correlative cryo-fluorescence microscopy and cryo-electron tomography applied to whole mitochondria in human endothelial cells.</a> Eur J Cell Biol. 88, 669-684 (2009).</li>
<li>Gaietta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+and+electron+microscopic+imaging+of+connexin+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking.</a> Science. 296, 503-507 (2002).</li>
<li>Sosinsky, G. E., Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Gaietta, G. M., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+for+correlated+light+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Markers for correlated light and electron microscopy.</a> Methods Cell Biol. 79, 575-591 (2007).</li>
</ol>

الكتاب تعلن أي تضارب المصالح المالية.

<p class="jove_content"&gt; استخدام مرحلتنا المبردة وتقنيات إعداد العينات ، والدراسات المتلازم بين البرد والبرد LM - EM يحمل العديد من الفوائد على درجة حرارة الغرفة التقليدية بما في ذلك النهج ، ولكن لا تقتصر على : التثبيت السريع<sup&gt; 1،2</sup&gt; ، خفضت photobleaching<sup&gt; 3</sup&gt; ، والمسح الضوئي للسلامة العينة قبل البرد EM<sup&gt; 4،5</sup&gt; أو الكيميائية التثبيت / التضمين<sup&gt; 6</sup&gt;. واحدة من العقبات لجمع البيانات البرد EM هو الوقت اللازم لنقل كل من العينة إلى تيم والمسح الضوئي الشبكة للعثور على المناطق المناسبة للصورة. مع اكتساب البرد LM بيانات السريع<sup&gt; 5</sup&gt; ، يمكن العثور على الوقت الذي يقضيه خلايا جيدة تقلص إلى حد كبير. وبالتالي ، يمكننا توفير الوقت والمال وتخفيف هذا الاختناق عن طريق مسح ورسم الخرائط مسبقة مجالات الاهتمام في البرد LM.</p&gt;<p class="jove_content"قد&gt; مراحل المبردة أكثر تكلفة أو معقدة تسمح التصوير دقة أعلى البرد LM. ومع ذلك ، فإن مرحلة ملفقة هنا هي أكثر من كافية للعديد من التطبيقات. إذا كان يتم تنفيذ البرد LM التصوير ونقل الشبكة عينة بحذر كما هو موضح في النص والفيديو ، ويمكن أن يتحقق بشكل كامل التصوير التلوث الحرة. هذا الأسلوب يسمح للارتباط المباشر لبيانات المجهر الفلورسنت والإلكترون من الخلية نفسها ، أو معقدة الجزيئات العضية فرقت على دعم الكربون أو الواردة ضمن قسم الأنسجة الرقيقة<sup&gt; 7</sup&gt;. تجدر الإشارة إلى أن قيمة هذه المرحلة المبردة يتجاوز دراسات المتلازم cryo-LM/cryo-EM إلى الحقل المجهري للضوء ككل. تناسب هذه المرحلة المبردة لكل من عينات الدقيق والأصباغ fluorophore / بقع<sup&gt; 8</sup&gt; ، نقاط الكم ، أو البروتينات الموسومة fluorescently<sup&gt; 9</sup&gt; التي قد تكون غير مستقرة خلال تثبيت درجة حرارة الغرفة الكيماوية وتضمينها مع غلوتارالدهيد وبارافورمالدهيد. نتيجة لذلك ، نأمل أن هذه المرحلة سوف المبردة توفير قدر أكبر من الوصول إلى المهتمين في البرد LM ، الذين تم ردع من قبل وصول التكلفة وغير كافية.</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; حل المشاكل البرد الخفيفة الميكروسكوب</em</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; 1. الامتزاز العينة :</emيمكن&gt; عينات مختلفة متغير يحمل خصائص امتصاص الكربون إلى الدعم. قد تجد أنه من الضروري استخدام أنواع أخرى من شبكات الدعم المستمر مثل الكربون والكربون holey ، أو شبكات لدعم المغلفة formvar العينة. بالإضافة إلى ذلك ، إذا كانت العينة ملزما للقضبان النحاس من الشبكة ، وليس على سطح الكربون ، قد يكون من الضروري ضبط كيمياء الكربون التي يحتضنها سطح الشبكة مع وكيل ترطيب أو توهج التفريغ قبل إضافة عينة.</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; 2. مرحلة الاستقرار :</em&gt; إذا لاحظت الاهتزاز ، فمن المرجح نظرا لكونها مرحلة عينة مثقلة الوزن بدلا من فقاعات من LN2. وزن المضافة للمرحلة المبردة ، يمكن أن تسبب الاهتزازات منخفضة التردد أحيانا أن يحيل على طول القياسية من 3 محاور السفر المرحلة المجهر ، وتؤثر سلبا على التصوير عبر طمس. هذا يمكن بسهولة يمكن تصحيحها من خلال دعم المرحلة المجهر للسفر من تحت إما مع رفع مصغرة للتعديل أو للتعديل مع محول المزدوج المسمار الأسلحة ، كما هو مبين في الفيديو. كل من هذه الآليات دعم تعديل تتفاعل مع جزء غير المنقولة للمرحلة السفر وبالتالي لا تزال تصاريح X و Y الترجمة المحور كما هو مطلوب للتصوير.</p

جدول محددة الكواشف والمعدات : <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم </th><th> شركة </th><th> كتالوج # </th><th> تعليقات </th><th> كلفة </th></tr><tr><td> 1-22،86 سم (9 &quot;) مع فطيرة لعموم حافة منحدر </td><td> حسن كوك </td><td></td><td> المحلية محل بقالة </td><td> 4،39 $ </td></tr><tr><td> 1-22،86 سم (9 &quot;) لعموم كعكة </td><td> حسن كوك </td><td></td><td> المحلية محل بقالة </td><td> 4،93 $ </td></tr><tr><td> 4 أزواج من عيدان </td><td></td><td></td><td> المحلية محل بقالة </td><td> 0،50 $ </td></tr><tr><td> 1 -- رش رغوة العظمى السخافات </td><td> كبير السخافات </td><td></td><td> الأجهزة المحلية مخزن </td><td> 5،98 $ </td></tr><tr><td> 1 -- 4cm x1cm x8cm كتلة من الألمنيوم </td><td></td><td></td><td> متجر لاجهزة الكمبيوتر المحلي أو المعدن ساحة للخردة </td><td> 10،00 $ </td></tr><tr><td> 5 -- # 10 1.91 سم (3 / 4 &quot;) رئيس شقة مشقوق البراغي ث / المكسرات </td><td></td><td></td><td> الأجهزة المحلية مخزن </td><td> 0،98 $ </td></tr><tr><td> جولة مشقوق # 4 0.95 سم (3 / 8 &quot;) البراغي ث / المكسرات -- 3 </td><td></td><td></td><td> الأجهزة المحلية مخزن </td><td> 0،98 $ </td></tr><tr><td> 15 -- # 10 غسالات </td><td></td><td></td><td> الأجهزة المحلية مخزن </td><td> 0،98 $ </td></tr><tr><td> 2 -- كتابة يجولون بلاستيكية شفافة </td><td></td><td></td><td> المكتب المحلي للتخزين </td><td> 6،84 $ </td></tr><tr><td> 1 -- المربع الشبكة كرو الحائز - EM </td><td> تيد بيلا </td><td> 160-41 </td><td></td><td> N / A </td></tr><tr><td> 1 -- كرو - EM معالجة قضبان مربع الشبكة </td><td> تيد بيلا </td><td> 160-46 </td><td></td><td> N / A </td></tr><tr><td> 1 -- R2 / 1 فيلم الكربون holey ، 400 شبكة سلكية النحاس دعم البرد EM </td><td> إمدادات SPI </td><td> 4340C - XA </td><td></td><td> N / A </td></tr></tbody></table> المواد التجريبية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سلالة الخميرة : Hta1 - CFP : كان (KSC - 3382 : ماتا ، ura3 - 52 ، lys2 - 801 ، ade2 - 101 ، trp1 - Δ63 ، his3 - Δ200 ، leu2 - Δ1 ، Hta1 - CFP : KanMX6 من المختبر كابلان في جامعة كاليفورنيا في ديفيس). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البرد الخفيفة المجهر : تم التقاط الصور المجهري البرد الضوء على DM4000M مجهر لايكا مع يعكس DFC310 ايكا الكاميرا CCD FX. تم الحصول عليها الميدانية مشرق ، والصور الميدانية داكن الإسفار باستخدام إما PL HCX FLUOTAR 5X 0.15 هدف الهواء العلوي ، وهو PL HCX FLUOTAR 10X 0،30 هدف الهواء العلوي ، وهو FLUOTAR PL 50x 0.55 هدف الهواء العلوي أو 100X NPLAN 0.75 هدف الهواء العلوي. يستخدم حقل الصور المشرقة والداكنة في حقل مصباح التنجستن 100W 12V كمصدر للضوء. لمضان ، تم استخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية مصدر EL6000 بالتزامن مع JC1 ايكا (Ex.F. : BP 480/30 ، DM : LP 505 ، SF BP 535/40 و LP 580) مكعب تصفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البرد نقل المجهر الإلكتروني : البرد EM تم الحصول على الصور مجهر إلكترون ناقل حركة العدل والمساواة - 2100 - FEG (JEOL ، اليابان) التي تعمل بسرعة 200 كيلو الاستفادة من وجود 626 غاتان البرد نقل صاحب (غاتان ، الولايات المتحدة). وسجلت في Micrographs الاسمية للتكبير X 50 ، 200 ، 1200 و 4000 على 4096 X 4096 بيكسل CCD Tietz (TVIPS ، Gauting ، ألمانيا). </li></ol>

منخفضة التكلفة المرحلة الميكروسكوب البرد الخفيفة التصنيع الخفيف مربوط / مجهرية إلكترون

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

اقتران البرد الخفيفة المجهري (البرد LM) والمجهري البرد الإلكترون (البرد م) تطرح عددا من المزايا لفهم ديناميات الخلوية والترآيب الدقيق. أولا ، يمكن تصوير الخلايا في بيئة الأم على حد سواء بالقرب من التقنيات. الثانية ، وذلك بسبب عملية التزجيج ، هي الحفاظ على العينات التي الشلل المادي السريع بدلا من بطء التثبيت الكيميائي. الثالثة ، والتصوير في نفس العينة مع كل من البرد والبرد LM - EM يوفر ارتباط البيانات من خلية واحدة ، بدلا من المقارنة بين &quot;عينات تمثيلية&quot;. بينما يعرف جيدا هذه الفوائد من الدراسات السابقة ، والاستخدام الواسع النطاق للالمتلازم البرد والبرد LM - EM لا يزال محدودا نظرا لتعقيد وحساب شراء أو بناء مناسبة المجهر الضوئي المبردة المرحلة. هنا علينا أن نظهر للجمعية العامة ، واستخدام المرحلة عن المبردة غير مكلفة التي يمكن أن تكون ملفقة في أي مختبر لأقل من 40 دولارا مع الأجزاء التي عثر عليها في الأجهزة المحلية ومحلات البقالة. تم تصميم هذه المرحلة البرد LM للاستخدام مع المجاهر الضوء المنعكس التي يتم تركيبها مع أهداف جوية طويلة في العمل عن بعد. للالمتلازم البرد والدراسات LM - EM البرد ، نكيف استخدام معيار الكربون المغلفة 3 ملم البرد كما يدعم شبكات EM العينة. بعد التكثيف العينة إلى الشبكة ، وتتبع البروتوكولات المعمول بها سابقا لالتزجيج العينة ونقل / مناولة الشبكة للسماح متعددة تقنية التصوير. نتيجة لذلك ، هذا الإعداد يسمح لأي مختبر المجهر مع الضوء المنعكس من الحصول على التصوير المباشر للعينات المترابطة رطب مجمد.

نبدي تلفيق مرحلة منخفضة التكلفة المبردة مصممة لتناسب معظم المجاهر الضوء المنعكس. هذه المرحلة بناء مختبر التصوير المبردة تمكن المتلازم كفاءة وموثوقية بين البرد الخفيفة والمجهري البرد الإلكترون.

يوفر الربط بين المجهر الضوئي المبرد (cryo-LM) والمجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) عددًا من المزايا لفهم الديناميات الخلوية...

مرحباً، أنا ديفيد كارلسون، طالب دراسات عليا في مختبر جيمس إيفانز في قسم الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية بجامعة كاليفورنيا ديفيس. سأوضح لكم في هذا الفيديو كيفية بناء منصة إضاءة تبريدية بسيطة وفعالة للمجهر الإلكتروني الضوئي التبريدي الارتباطي. تتكون المنصة التبريدية من نافذة رؤية شفافة، وفتحة للعدسات الشيئية، ومصب للنيتروجين السائل، ومبدد حراري لمعاينة العينة، وحامل لنقل العينة.تم شراء غالبية المواد المستخدمة من متجر محلي للأجهزة والمواد الغذائية. وتتكون هذه المواد من صينية فرن مقاس تسع بوصات، وصينية كيك مقاس تسع بوصات، وأربعة أزواج من عيدان الأكل الصينية، ورغوة رش محشوة، وكتلة من الألومنيوم بأبعاد 4 cm في 8 cm في 1 cm مثقوبة بفتحات تثبيت لـ 5 براغي من المقاس 10. وبراغي وصواميل مسطحة الرأس ذات شق من المقاس 10 وطول 3/4 بوصة، وثلاثة براغي وصواميل مستديرة ذات شق من المقاس 4 وطول 3/8 بوصة، و15 حلقة تثبيت (washers) من المقاس 10، ولوحين كتابة بلاستيكيين شفافين، وماء، وحامل صندوق شبكات cryo EM وقضيب مناولة، والتي يمكن شراؤها من Ted Pella.ضع طبق الفطيرة على منصة المجهر تحت العدسات الشيئية. ضع كتلة الألومنيوم بالقرب من حافة الطبق ثم قم بضبط التركيز على سطح الألومنيوم. تحقق من أن العدسات الشيئية يمكنها التحرك بحرية ذهاباً وإياباً فوق حافة طبق الفطيرة.وإذا لم يكن كذلك، أعد ضبط موضع الكتلة الألومنيومية وتحقق مرة أخرى. وبمجرد تحديد موقع الكتلة الألومنيومية، حدد موضع براغي التثبيت باستخدام قلم تحديد. ضع صندوق الشبكات المبردة بجوار الكتلة الألومنيومية، وباستخدام قلم تحديد، سجل موضع الثلمة وكل جانب من جوانب صندوق الشبكات المبردة مع تسجيل مخطط البراغي على سطح طبق بيترى.استخدم مسماراً حاداً ومطرقة لعمل ثقوب ابتدائية عند كل نقطة من النقاط المحددة باستخدام ريشة مثقاب مقاس 17. قم بحفر الثقوب المخصصة لتثبيت الكتلة الألومنيومية، مع تنعيم حواف كل ثقب.بعد ذلك، استخدم ريشة مثقاب مقاس 35 لحفر وتدوير الثقوب المخصصة لتركيب صندوق الشبكة المبردة، وهو طبق البيض. بعد التجهيز والحفر، أدخل براغي مسطحة الرأس ذات شق مقاس 10 وبطول ثلاثة أرباع البوصة في الثقوب الموجودة في الكتلة الألومنيوم، وضع وردتين من مقاس 10 SAE فوق كل جزء من الكتلة الألومنيوم.فتحات التثبيت في الطبق الدائري. بعد ذلك، قم بتثبيت الكتلة باستخدام أصابعك لبدء ربط كل مسمار، ثم أحكم ربطها باستخدام المثقاب. اقلب الطبق الدائري وضع حلقة تثبيت رقم 10 على كل مسمار وثبتها بصامولة.استخدم مفتاح ربط للتأكد من إحكام ربط جميع الصواميل. بعد ذلك، ومن الجهة الخلفية لطبق التقديم، ضع البراغي رقم 4 ذات الرأس المستدير والمشقوق عبر فتحات تثبيت صندوق شبكة التجميد (cryo grid box)، ثم أحكم ربطها باستخدام صامولة من أعلى الطبق.بعد اكتمال الجزء العلوي من منصة التجميد، سنقوم بتوضيح كيفية نقل صندوق شبكات التجميد في غياب كل من لوحة المشبك البلاستيكية والنيتروجين السائل. بعد ذلك، نبدأ في تحضير قالب الرغوة العازلة. ابدأ بتثبيت عيدان الطعام بالشريط اللاصق في حزم ثنائية.بعد ذلك، قم بتثبيت كل حزمة من أعواد الطعام بشريط لاصق على حافة صينية الكيك بحيث تكون كل واحدة مقابلة للأخرى. والغرض من أعواد الطعام هو ضمان الحصول على سمك موحد للعزل الرغوي. بعد ذلك، قم بترطيب صينية الكيك والسطح السفلي لطبق الفطيرة بالماء.ابدأ بإضافة طبقة واحدة من رغوة Great Stuff. رُش الرغوة على كامل قاع وعاء الكيك ثم رُشها بالماء. أضف طبقة ثانية من رغوة Great Stuff ثم رُشها بالماء.اضغط طبق الفطيرة بالتساوي وبقوة داخل صينية الكيك. اقلب الأطباق المجمعة وضع ثقلاً كبيراً فوقها. اترك الرغوة لتتصلب طوال الليل.بمجرد تصلب الرغوة، استخدم سكيناً مسنناً لقطع الطبق وتحريره، ثم أزل الرغوة الزائدة من جوانب الطبق. أزل الفواصل المكونة من عيدان الطعام وافصل طبق الفطيرة عن صينية الكيك. يجب أن تظل الرغوة ملتصقة بطبق الفطيرة.بعد ذلك، ضع منصة التبريد (cryo stage) أسفل العدسة الشيئية وضع لوحة ملاحظات بلاستيكية فوقها. وباستخدام قلم تحديد، تتبع مسار العدسات الشيئية أثناء تأرجحها للداخل والخارج. ضع علامة X بعيداً عن نصف الدائرة وبالقرب من حافة طبق بيترى.باستخدام لوحة المشابك الثانية، حدد موقع نقطة تثبيت صندوق شبكة الحشد. قم بتفريغ الفتحة المخصصة لصندوق شبكة الحشد باستخدام مثقاب ومنشار ثقوب بقطر ثلاثة أرابع البوصة، ثم اضغط على لوحة المشابك الأخرى. قم بتفريغ علامة X باستخدام منشار ثقوب بقطر ثلاثة أرابع البوصة.قم بإزالة المنطقة نصف الدائرية عن طريق القطع عدة مرات باستخدام منشار ثقوب بحجم ثلاث بوصات ومكبس مثقاب، وبذلك تكون عملية التصنيع قد اكتملت. تشمل المواد اللازمة لتحضير العينات صندوق شبكات التجميد (cryo grid box) وقضيب مناولة، وملاقط، وكتلة نقل صندوق شبكات التجميد، وممسحة كيميائية ممزقة، وكوب تبريد، وكوب liquid et ethan، وشبكات EM من الكربون المثقب (holy carbon) بفتحة R two one ومسامية 400 mesh، وصندوق من الفلين (styrofoam)، ومجمد غمر هوائي (pneumatic plunge freezer). قم بتبريد صندوق الفلين، وصندوق شبكات التجميد، وكتلة النقل، وكوب التبريد، وكوب liquid et ethan رأسيًا باستخدام النيتروجين السائل.بعد ذلك، ضع صندوق شبكات التجميد في كتلة نقل صندوق شبكات التجميد. استخدم الملاقط لإمساك شبكة المجهر الإلكتروني بحيث يكون الجانب الكربوني للأعلى. ضع 2 µL من معلق الخلايا بتركيز 2 × 10⁶ cells/mL على الجزء العلوي من الشبكة.ثبّت الملاقط على المكبس الهوائي، ثم اسحب السائل من سطح الشبكة عن طريق تثبيت قطعة ممزقة من منديل تنظيف المختبر (chem wipe) في الجانب الخلفي لشبكة المجهر الإلكتروني (EM grid) وغمرها في ملاط الإيثان السائل. انقل الشبكة بسرعة من الإيثان السائل إلى النيتروجين السائل وضعها في صندوق شبكات التجميد (cryo grid box). لاستخدام منصة التجميد، ابدأ بملء الطبق بالنيتروجين السائل ثم غطّه بلوحة تثبيت.بعد نقل صندوق الشبكات المبردة عبر الفتحة الموجودة في لوحة التثبيت البلاستيكية، أخرج شبكة واحدة من الصندوق وضعها على سطح الرؤية في الكتلة الألومنيومية. وبعد تحريك منصة التجميد إلى موضعها في المجهر، ضع لوحة التثبيت الثانية فوق الأولى ثم اسحب لوحة التثبيت الأولى للخارج بعناية.قم بتركيب العدسات الشيئية واستخدم المجهر كالمعتاد. ابدأ بعملية المسح واستخدم تكبيراً منخفضاً لتحديد مركز الشبكة المشار إليه بثلاثة لسانات معدنية. هنا، قم بضبط التركيز عند 50 x.يمكنكم رؤية طبقة رقيقة من الجليد الزجاجي تغطي الشبكة وهي تتحول إلى الفلورية. كما يمكنكم رؤية واسم الهيستون CFP متمركزاً في نواة الخلية. بعد ذلك، سأقوم بتحويل العدسات الشيئية إلى 100x والتركيز على خلايا خميرة فردية.لإزالة منصة التبريد (cryo stage) من المجهر، ضع لوحة المشابك الأولى فوق الثانية ثم اسحب لوحة المشابك السفلية للخارج بعناية. قم بإزالة منصة التبريد من المجهر وأعد الشبكة إلى صندوق شبكات التبريد (cryo grid box) باستخدام الفتحة الموجودة في لوحة المشابك. وأخيراً، قم بربط قضيب مناولة صندوق شبكات التبريد في الصندوق وانقله إلى النيتروجين السائل لحفظه من أجل الفحص في وقت لاحق.تعد استقرار منصة المجهر الإلكتروني أمراً بالغ الأهمية. وقد وجدنا في المجهر أن معظم عدم استقرار الصورة في نظامنا ينجم عن الوزن المضاف لمنصة التبريد العميق على منصة المجهر. وفي حالة عدم وجود النيتروجين السائل، يمكننا ملاحظة قدر كبير من عدم الاستقرار عند التركيز على الكتلة المصنوعة من الألومنيوم.يتم تقليل عدم الاستقرار بشكل كبير من خلال إضافة دعامة إلى مقدمة منصة المجهر. أعرض هنا هيكل دعم يتكون من آلية برغي قابلة للتعديل أضعها بين منصة المجهر والقاعدة. كما يظهر أثر الدعم الإضافي في المجهر الضوئي المبرد (cryo light microscopy)، مما يثبت أن عدم الاستقرار ناتج عن الوزن المضاف وليس عن فقاعات النيتروجين السائل.كما ترون، تعد منصة الإضاءة المبردة هذه طريقة غير مكلفة ومفيدة لجمع المعلومات الفلورية للخلايا المجمدة والمميّهة. ويسمح المسح في المجال المضيء والمجال المظلم برسم خرائط للمناطق ذات الجليد المنتظم. وبمجرد تحديد هذه المناطق ذات الأهمية، يمكننا استخدام القناة الفلورية لرؤية الفلور المستخدم لوسم البروتينات المستهدفة، وهو في هذه الحالة وسم CFP histone.بعد التقاط الصور باستخدام الفلورة بالتبريد، يمكننا استخدام صور التكبير المنخفض لرسم خرائط وتحديد الشبكة والمربع ذاتهما، ثم تصوير الخلايا نفسها باستخدام المجهر الإلكتروني بالتبريد. وكما تلاحظون، فإن منصة الإضاءة بالتبريد هذه تعد وسيلة مفيدة وغير مكلفة لجمع الصور الفلورية لعينات الهيدروجين المجمدة. كما يمكن ملاحظة المنطقة ذاتها في المجهر الإلكتروني بالتبريد من خلال اتباع تقنيات النقل والتصوير القياسية للمجهر الإلكتروني بالتبريد.في هذه الحالة، تعمل بيانات المجهر الضوئي المبرد كخريطة مرجعية لتحديد المنطقة الدقيقة للدراسة الارتباطية. يمكن تطبيق هذه المرحلة على التصوير الارتباطي لأنواع عديدة من العينات، بما في ذلك الخلايا الكاملة في التفاعلات المختبرية للمجمعات الجزيئية الكبيرة أو العضيات المعزولة والمقاطع المبردة الرقيقة من الأنسجة. شكراً للمشاهدة، ونأمل أن تجدوا مرحلة المجهر الضوئي المبرد هذه مفيدة كما هي بالنسبة لنا.

low-cost-cryo-light-microscopy-stage-fabrication-for-correlated

Research

JoVE Journal

Bioengineering

الهندسة الحيوية

Lensfree البصرية التصوير المقطعي هو تقنية المجهر ثلاثي الأبعاد الذي يوفر القرار المكانية من ميكرون 1 &lt;× &lt;× 1 ميكرومتر &lt;3 ميكرومتر في سين وصاد وأبعاد Z، على التوالي، أكثر من حجم التصوير كبيرة من 15-100...

Lensfree الميكروسكوب تصوير الشعاعي الطبقي على رقاقة ويعمل لدى الشركة متعددة زاوية الإضاءة وبكسل سوبر قرار

نحن تصف طريقة المجهر المتلازم الذي يجمع بين السرعة العالية 3D الخلية الحية المجهري ضوء الفلورسنت وعالية الدقة البرد الإلكترون التصوير المقطعي. علينا أن نظهر قدرة أسلوب مترابط عن طريق التصوير الديناميكي، صغيرة HIV-1 جزيئات التفاعل مع خلايا هيلا المضيف.

الميكروسكوب المتلازم لتحليل الهيكلية 3D من التفاعلات الدينامية

هنا ، نقوم بتصنيع هياكل بوليمرية دقيقة / نانو ثلاثية الأبعاد يمكن فيها هندسة كل من الشكل والمحاذاة الجزيئية بدقة مقياس نانومتر باستخدام الكتابة بالليزر المباشر. يمكن التحكم في التشوه الناجم عن الضوء لعدة أنواع من الهياكل المجهرية المطاطية البلورية السائلة في المقياس المجهري.

المحركات الخفيفة ذات شكل حر - تصنيع ومراقبة يشتغل في مقياس المجهري

يتم تطبيق أسلوب ستتحقق خفيفة الميكروسكوب الإلكتروني (كليم) للصورة التي يسببها فيروس هياكل داخل الخلية عبر الميكروسكوب الإلكتروني (م) في الخلايا التي تم تحديدها سابقا عن طريق الخفيفة الميكروسكوب (LM). وضم كنهج تصوير هجين لتحقيق رؤية متكاملة للفيروس--المضيف التفاعلات LM وم.

المجهر الإلكتروني الارتباطية الخفيفة (كليم) لتتبع وتصوير البروتينات الفيروسية المرتبطة الهياكل في الخلايا المعطل تداولها البرد

المجهر البصري فائقه الدقة المستندة إلى الرقاقة هو نهج جديد للمجهر الفلوري ويقدم مزايا في فعاليه التكلفة والانتاجيه. هنا ، يتم عرض بروتوكولات لاعداد رقاقه والتصوير لمجهر TIRF والتعريب المستندة إلى المجهر فائقه الدقة.

عاليه الانتاجيه الكلي الداخلية انعكاس الفلورية والتوجيه العشوائي البصرية أعاده البناء المجهري باستخدام رقاقه فوتوسونيك

يوضح هذا البروتوكول كيفية تصوير العينات البيولوجية المحفوظة بالتبريد باستخدام المجهر الإضاءة منظم التبريد. نحن نثبت المنهجية من خلال تصوير الهيكل الخلوي لخلايا U2OS.

جمع البيانات المجهرية للإضاءة المهيكلة بالتبريد من الخلايا المحفوظة بالتبريد

استخدام طحن الحزم الأيونية المركزة لإنتاج صفائح زجاجية على الشبكة من العينات البيولوجية المجمدة للتصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد.

تحضير الصفائح من العينات البيولوجية الزجاجية باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح ثنائي الحزمة للتصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد

يصف البروتوكول توليد كروي عالي الإنتاجية للطباعة الحيوية باستخدام التحليل متعدد المعلمات للأكسجين وموت الخلايا على مجهر فلوري قياسي. يمكن تطبيق هذا النهج للتحكم في صلاحية الكرويات وإجراء التوحيد القياسي ، وهو أمر مهم في نمذجة الأنسجة 3D ، والبيئة الدقيقة للورم ، والتصنيع الحيوي الناجح (الدقيق) للأنسجة.

التصنيع الحيوي بمساعدة الأكسجين بمساعدة الأكسجين بأسعار معقولة للكرويات متعددة الخلايا

تم تطوير إطار تصوير فائق الطيفية متعدد الوسائط وسريع للحصول على صور توليد مجموع التردد الاهتزازي عريض النطاق (VSFG) ، جنبا إلى جنب مع طرائق التصوير من الجيل التوافقي الثاني (SHG). نظرا لتردد الأشعة تحت الحمراء الذي يتردد صداه مع الاهتزازات الجزيئية ، يتم الكشف عن المعرفة المورفولوجية الهيكلية المجهرية والميزوسكوبية للعينات المسموح بها بالتناظر.

التصوير الكيميائي الطيفي غير الخطي متعدد الوسائط باستخدام مجهر توليد مجموع التردد الاهتزازي للمسح الخطي

يصف هذا البروتوكول بالتفصيل كيفية بناء مجهر مضان أحادي الهدف وضوء ورقة واستخدامه لتصور شبكات الهيكل الخلوي.

تصميم وبناء مجهر مضان أحادي الهدف قابل للتخصيص لتصور شبكات الهيكل الخلوي

يتيح سير العمل هذا إنتاج الصفيحة التي تستهدف الهياكل البيولوجية ذات العلامات الفلورية الصغيرة (&lt;1 ميكرومتر في المدى المحوري) والنادرة (نسخة واحدة لكل خلية) باستخدام منصة تصوير ثلاثية متزامنة مبردة. تدمج هذه المنصة الفحص المجهري الفلوري ، وطحن الشعاع الأيوني المركز ، والفحص المجهري الإلكتروني الماسح في موضع بؤري واحد وتمكن الفحص المجهري الفلوري المتزامن أثناء الطحن.

سير العمل باستخدام مجهر مضان وإلكتروني وشعاع أيوني متزامن مبرد للطحن المستهدف للخلايا

تعلم تصنيع منصة تبريد ميكروسكوبية منخفضة التكلفة لتمكين التصوير المجهرية الإلكترونية والضوئية المتزامن للعينات البيولوجية المجمدة باستخدام مواد متوفرة محلياً.

منخفضة التكلفة المرحلة الميكروسكوب البرد الخفيفة التصنيع الخفيف مربوط / مجهرية إلكترون

استكشف المزيد من الفيديوهات