الجزئي الميكانيكية توصيف أنسجة الرئة باستخدام القوة الذرية الميكروسكوب

الهدف العام من التجربة التالية هو توصيف البيئة الميكانيكية المحلية لحمة الرئة على نطاق مكاني ذي صلة بالخلايا المقيمة عن طريق القياس المباشر للخصائص المرنة المحلية لأنسجة الرئة المتطابقة الجديدة باستخدام المسافة البادئة المجهرية للقوة الذرية. يتم تحقيق ذلك عن طريق قطع أنسجة رئة الفأر المتضخمة من الأغارو بشفرة حلاقة أو مشرط لتحضير شرائط حمة الرئة بطول وعرض خمسة ملليمترات وسمك 400 ميكرومتر. التالي شرائط أنسجة الرئة غير الثابتة un perme هي صبغة مناعية ، والتي تحدد مجالات الاهتمام للمسافة البادئة الدقيقة FM.

ثم يتم إجراء فجوة دقيقة FM على شرائط الأنسجة في PBS في درجة حرارة الغرفة. من أجل قياس الخصائص المرنة المحلية لأنسجة الرئة الطازجة بشكل مباشر ، يتم الحصول على النتائج. يظهر ذلك اختلافات مذهلة في نطاق وتوزيع تصلب الأنسجة في حمة الرئة الطبيعية والليفية والاختلافات المكانية الكبيرة في التصلب ، خاصة داخل عينة الرئة الليفية.

استنادا إلى خرائط الصلابة المستخرجة من منحنيات الإزاحة القسرية التي تم الحصول عليها باستخدام المسافة البادئة الدقيقة FM. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على المقياس الحالي مثل تمدد شريط الأنسجة هي أنها توفر دقة مكانية غير مسبوقة توفر منظورا فريدا للتباين الدقيق في تصلب الأنسجة. يمكن أن يساعد هذا المقياس في الإجابة على أسئلة رئيسية مثل كيفية اختلاف التصلب مكانيا داخل الأنسجة وما هو النطاق والنطاق المكاني لتغيرات الصلابة في المرض.

العمليات التي تؤدي إلى إعادة تشكيل الأنسجة لتحضير شرائح من أنسجة الرئة تبدأ بتثبيت بنية الرئة للقطع عن طريق تضخيم رئتي الفأر المعزولة. داخل القصبة الهوائية مع 50 مل لكل كيلوغرام من وزن الجسم الدافئ ، 2٪ نقطة هلام منخفضة المحضرة في PBS تربط القصبة الهوائية وتبريد الرئتين المنتفختين في حمام PBS عند أربع درجات مئوية لمدة 60 دقيقة. سوف يتجلد ويصلب القوس في المساحات الهوائية لتثبيت بنية الرئة بلطف خلال هذه الفترة ، باستخدام ماكينة حلاقة أو مشرط ، قم بتقطيع أنسجة رئة الفأر المستقرة إلى شرائح يبلغ طولها وعرضها حوالي خمسة × خمسة ملليمترات ، وسماكة 400 ميكرومتر.

ثم اغسل الشرائط في PBS عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق لإزالة الشقوق المتبقية لاستبعاد المسالك الهوائية والأوعية الكبيرة. قطع شرائط من المناطق تحت الجنبة البعيدة عن القصبات الهوائية الجذعية الرئيسية إذا كانت الممرات الهوائية en أوعية كبيرة سيتم تصويرها قطع شرائط من أنسجة الرئة أكثر قربا إلى القصبات الهوائية الجذعية الرئيسية لعزل مناطق الاهتمام لمسافة بادئة دقيقة FM. تصور الأنسجة عن طريق الفحص المجهري المتباين للوجه أو البقع المناعية وتصورها عن طريق الفحص المجهري الفلوري.

يرجى الاطلاع على الجزء المكتوب من هذا البروتوكول للاطلاع على الإجراء. مباشرة قبل توصيف FM ، قم بإرفاق شرائط الأنسجة بغطاء بولي L lysine المطلي ب 15 ملم عن طريق رفع زلة الغطاء من أسفل الأنسجة العائمة ، مع التأكد من أن شريط الأنسجة ينتشر بالتساوي على سطح انزلاق الغطاء. إذا لزم الأمر ، قم بشطيرة الشريط بزلة غطاء نظيفة ثانية غير مطلية وقم بالضغط الخفيف للمساعدة في ربط الأنسجة بزلة الغطاء المطلي ب poly L lysine.

بمعايرة نظام A FM باتباع تعليمات الشركة المصنعة مباشرة قبل كل جولة من تجارب المسافة البادئة الدقيقة. لهذا ، حدد معلمتين مهمتين. ثابت زنبرك الكابولي باستخدام طريقة التذبذب الحراري في الهواء وحساسية انحراف الكابولي ، وهي معلمة تستخدم لقياس إشارة خرج الصمام الثنائي الضوئي إلى مسافة انحراف الكابولي الفعلية.

معايرة حساسية الانحراف عن طريق الحصول على منحنى الإزاحة القسري القياسي في PBS على شريحة زجاجية نظيفة. ثم احسب ميل منحنى الإزاحة القسرية في قياس منحنى الإزاحة القسرية. يتم تمديد طرف FM A نحو سطح العينة وسحبه منه في مكان واحد مع مراقبة انحراف دلتا الكابولية D كدالة لدلتا إزاحة الطرف Z.It يوصى باستخدام ناتئ مثلث نيتريد السيليكون برأس كروي بقطر خمسة ميكرومتر بو سيليكات باستخدام مجسات FM بثابت زنبركي يبلغ 0.06 نيوتن لكل متر.

لقد قمنا بتمييز المواد اللينة ميكانيكيا مع تعديل شفاف يمتد من 100 إلى 50،000 باسكال. امسح السطح السفلي لغطاء العينة بالمناديل الورقية ، ثم اربطه بشريحة زجاجية قياسية بشحم مفرغ من الهواء. قم بتركيب الشريحة الزجاجية على مرحلة عينة A FM وقم بتغطية الأنسجة ب 500 ميكرولتر من PBS بدرجة حرارة الغرفة.

ثم ضع رأس مسح FM فوق العينة. اضبط مرحلة عينة المجهر لضبط المجهر لعرض العدسة لمحاذاة طرف A FM في وسط مجال الرؤية. حرك مرحلة عينة A FM لاختيار منطقة الاهتمام على الأنسجة.

ثم قم بالتبديل إلى عرض كاميرا CCD لتسجيل صورة تباين الطور و / أو صور مضان للأنسجة حسب الرغبة. حرك طرف FM ببطء لأسفل حتى يتلامس مع العينة بدقة. يتطلب توصيف المسافة البادئة الدقيقة FM للعينات اللينة أعماق مسافة بادئة صغيرة لتجنب السلالات المحلية الكبيرة ، والتي تبطل نموذج الهرتز المستخدم لحساب معامل المرونة لتجنب السلالات الكبيرة ، وإجراء المسافة البادئة في وضع الزناد عن طريق ضبط الحد الأقصى للانحراف الكابولي على 500 نانومتر.

سيؤدي حد الانحراف هذا إلى تقييد قوة المسافة البادئة القصوى إلى أقل من 30 نانو نيوتن. يجب اختيار سرعة المسافة البادئة لتكون بطيئة بما فيه الكفاية لاستكشاف الخصائص المرنة بدلا من اللزجة المرنة للعينة الناعمة. حدد نطاق سرعة يتراوح من اثنين إلى 20 ميكرومتر في الثانية لأنسجة الرئة لقياس واحد من منطقة الاهتمام.

انقل مسبار FM إلى موقع الاهتمام وقم بإجراء مسافة بادئة واحدة لجمع منحنى إزاحة القوة القياسي. سيتحرك المسبار فقط في الاتجاه Z. لتعيين تلقائي لمنطقة ذات اهتمام، قم بالتبديل إلى وضع الخريطة القوية، وحدد حجم المسح ونقاط أخذ العينات داخل المنطقة المحددة.

يجمع طرف A FM RAs عبر سطح العينة بين حركات المسافة البادئة ويجمع منحنيات الإزاحة القسرية الفردية في كل نقطة داخل شبكة عينة محددة مستقلة. وجدنا أنه من العملي استخدام شبكة عينة 16 × 16 لرسم خريطة لمساحة 80 ميكرومتر × 80 ميكرومتر بسرعة مسافة بادئة تبلغ 20 ميكرومتر في الثانية ، والتي يمكن إكمالها في حوالي 10 دقائق. لحساب معامل يونغ ، قم بملاءمة منحنى إزاحة القوة مع نموذج المسافة البادئة الكروية للهرتز باستخدام تركيب المنحنى غير الخطي لمربع لي كما هو موضح هنا حيث F يساوي K ، و C مضروبة في دلتا D هي قوة ثني الكابولي.

K الفرعي C هو ثابت الزنبرك الكابولي. R هو دلتا نصف قطر طرف الكرة يساوي دلتا Z ناقص دلتا D هي المسافة البادئة ، والجديد هو نسبة بواسون العينات ، والتي تساوي 0.4 لأنسجة الرئة. لتقييم جودة الملاءمة ، احسب قيمة SSR أو مجموع مربعات الفرق بين البيانات وقيم الملاءمة أثناء تركيب المنحنى غير الخطي.

تخلص من القياسات غير الموثوقة أو غير القابلة للتفسير عن طريق تجاهل البيانات من المنحنيات السيئة ذات قيم SSR الكبيرة. إذا رغبت في ذلك ، قم بتحويل معامل المرونة أو E إلى معامل مطلق. ز-استخدام العلاقة E يساوي ضعفين مجموع واحد زائد الأوقات الجديدة G.To تصور الأنماط المكانية للصلابة المجمعة في أسلوب خريطة القوة وبيانات معامل الرسم والخرائط الكفافية ، على سبيل المثال ، في شبكة 16 × 16 تغطي مساحة 80 ميكرومتر × 80 ميكرومتر.

لمعالجة كمية كبيرة من بيانات منحنى القوة ، يمكن كتابة خوارزمية مخصصة لتناسب منحنيات إزاحة القوة تلقائيا ، أو استخراج خرائط كفاف معيارية و / أو خرائط كفاف مخططة أو طعم ELA. باستخدام نفس الإجراءات والمعلمات الموصوفة للتو ، يوضح هذا الشكل أنني أقوم بقطع الأنسجة وصخبها بشكل صحيح. يتم الحفاظ على الحمة السنخية الدقيقة للرئة بشكل جيد كما لوحظ من خلال تلطيخ الفلورسنت المناعي لمكون الغشاء القاعدي ، اللامينين بدون تثبيت أو اختراق.

تظهر هذه الألواح تلطيخا مناعيا فلوريا للكولاجين ، أحدهما في الرئتين الطازجة غير المثبتة التي تم حصادها من الفئران التي عولجت سابقا ب PBS أو عولجت ببليو مايسين للحث على التليف. يتم عرض مخططات إزاحة قوة العينة التي تم الحصول عليها من المسافة البادئة الدقيقة FM هنا بنفس القوة المطبقة. يولد طرف A FM مسافة بادئة كبيرة على منطقة ناعمة مما ينتج عنه منحنى إزاحة قوة مسطح نسبيا موضح باللون الأزرق مقابل مسافة بادئة صغيرة ومنحنى إزاحة قوة حادة لمنطقة أكثر صلابة موضحة باللون الأحمر.

من أجل الحصول على منحنيات قوة نظيفة بعد كل مسافة بادئة ، يجب سحب طرف A FM تماما من سطح العينة وخالي من التلامس قبل المسافة البادئة التالية. تتوافق هذه الحالة الحرة للاتصال مع المنطقة المسطحة من المنحنى حيث يترجم الطرف دون انحراف ناتئ. يوضح هذا الشكل منحنى خاطئا نموذجيا بدون منطقة مسطحة ، والذي يحدث عندما لا يتم سحب الطرف تماما من سطح العينة ، كما هو الحال عندما تلتصق العينة الناعمة بالحافة ، مما يجعل من المستحيل تحديد نقطة التلامس إذا كان الطرف محاصرا تماما في عينة ناعمة.

قد يبدو المنحنى هكذا دون انحراف واضح ، ولكن ضوضاء صغيرة. هذا الشكل يظهر الصلابة. تم عرض البيانات المستخرجة من منحنيات الإزاحة القسرية مكانيا كخرائط صلابة يشار إليها باسم طعم ELAs حيث تظهر مقاييس الألوان ذات الصلابة تباينات مذهلة في نطاق وتوزيع تصلب الأنسجة في حمة الرئة الطبيعية والليفية والاختلافات المكانية الكبيرة في التصلب ، لا سيما داخل عينة الرئة الليفية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توصيف البيئة الميكانيكية المحلية لحمة الرئة عن طريق قياس الخصائص المرنة المحلية لأنسجة الرئة الطازجة مباشرة باستخدام نسخة مجهرية من القوة الذرية.