الفيروسة البطيئة بوساطة التلاعب الجيني والتخيل من العصبونات الحسية الشمية في الجسم الحي
مايو 22, 2011
نقدم تقنية للتلاعب الجيني lentiviral والتصور وحيدة الخلية العصبية الحسية الشمية محوار في محطة وتشجر في الجسم الحي.
يتمثل أحد تحديات دراسة التطور في علم الأعصاب في التقاط الأشكال المتغصنة والمحورية على مستوى خلية واحدة في الجسم الحي. في الجهاز الشمي ، تمد الخلايا العصبية الحسية الشمية محاورها من الظهارة الشمية في الأنف إلى البصلة الشمية في الدماغ. عندما تنسقط الخلايا العصبية الحسية الشمية المتعددة نحو البصلة الشمية ، فإنها تتحول إلى حزم.
هذا يعقد دراسة مسارات المحاور العصبية الفردية وأشكالها النهائية. لقد طورنا طريقة لتصور الخلايا العصبية الحسية الشمية المفردة في الجسم الحي عن طريق الحقن الدقيق لبناء GFP. تحمل فيروس العدس.
يضيء التنبيغ الناجح باستخدام فيروس العدسات طول المحور الحسي الشمي بالكامل ، بما في ذلك الشجرة الطرفية. بالإضافة إلى تصور الخلايا العصبية الحسية الشمية المفردة ، تسمح لنا هذه الطريقة بمعالجة التعبير الجيني لجين معين ذي أهمية لدراسة وظيفته في سياق في الجسم الحي. إجراء الفيروس العدسي هذا هو مستوى السلامة الحيوية الثاني ويجب إجراؤه في غطاء التدفق الرقائقي.
للحفاظ على بيئة معقمة ، قم برش كل شيء يتم إدخاله في الغطاء بنسبة 70٪ من الإيثانول في الغطاء ، وقم بإعداد وتسخين طبقة مائية بدرجة حرارة 37 درجة لمدة 20 دقيقة على الأقل. قبل الحقن. أغلق كيس تخزين بلاستيكي نصف ممتلئ بالماء وضعه على حاضنة كتلة تسخين فارغة.
سيسمح ذلك للفئران بالتعافي بعد الحقن. املأ حاوية النفايات البيولوجية المبيضة بنسبة 10٪ لتطهير جميع المواد المعرضة للفيروسات. من هذا الإجراء ، قم بإعداد طبق صغير مفتوح من 70 ٪ من الإيثانول وطبق ثان بالماء المقطر المعقم.
في غطاء التدفق الصفحي ، سنستخدم حقنة هاميلتون بسعة خمسة ميكرولتر مع إبرة قياس 33. يسمح لك هذا النموذج المعين بضبط مقاومة المكبس عن طريق تدوير قرص الشد الموجود في الجزء العلوي من غرفة المكبس. توفر هذه الميزة التحكم في حجم الحقن المجهري لتعقيم غرفة الإبرة والحقنة.
استنشق الإيثانول وإخراجه مرارا وتكرارا من الطبق عدة مرات. اشطف خرطوشة الحقنة عن طريق شفط وإخراج الماء المعقم عدة مرات. ضع المحقنة جانبا بأمان في غطاء التدفق.
رتب مناديل الكحول المبللة بالقرب من محطة الحقن. قم بإعداد مرحلة الحقن التي توفر سطحا مرتفعا يسهل وضع الماوس. يمكن للمرء استخدام طبق ثقافة مقلوب يبلغ طوله 10 سم مغطى بمناديل كيم.
يمكن تخدير صغار الفئران عن طريق انخفاض حرارة الجسم حتى سن الفطام. اقطع إصبع من قفاز مطاطي وضع جرو الفأر في قطع الإصبع. ثم ضعه على الثلج لمدة خمس دقائق.
سيمنع القفاز حروق الجلد التي قد تحدث من ملامسة الجلد المباشر لاختبار الجليد للتخدير الشامل عن طريق الضغط على مؤخرة الجرو وأربعة أقدام للتأكد من أن لا يستجيب. نحن الآن مستعدون للحقن المجهري لفيروس العدس. سنتظاهر مع جرو حديث الولادة.
إذا تم استخدام سن أكبر من الفأر ، فيجب على المرء استبدال إبرة قياس 33 بإبرة قياس أكثر سمكا من أجل اختراق سطح الجمجمة. عقم سطح أنف الفأر عن طريق مسحه بقطعة كحول. قم بإزالة مخزون العدسات من تخزين الفريزر وقم بإذابة الثلج.
لقد أنتجنا فيروس العدسات في المختبر بأنفسنا باستخدام الأساليب المعمول بها. عند تطوير هذه الطريقة ، وجدنا أن الحد الأدنى من العيار الفيروسي من 10 إلى الوحدات المعدية التاسعة لكل مل مطلوب لمعدل نقل جيد. استنشق ميكرولترين من محلول مخزون العدسات إلى حقنة هاميلتون المعقمة.
ضع جرو الفأر أعلى مرحلة الحقن. أمسك الجلد أعلى الرأس عند الأذنين ، واسحبه برفق. لقد قمنا بتجهيز غطاء التدفق الخاص بنا بنطاق تشريح.
من أجل توجيه الحقن الدقيقة بدقة ، ابحث في سطح الجمجمة الظهرية في الدماغ الأمامي عن مخطط للبصلة الشمية. تحيط أهداف الحقن الدقيقة الخاصة بنا عن كثب بمصباح الشم ، ولكن يجب ألا تشمل البصلة نفسها. نعطي أربع حقن في الظهارة الشمية لكل جرو.
تتطلب هذه المواضع الممثلة بنقاط زرقاء إدخال الإبرة بزاوية موجهة وسطيا. الحقنتان الإضافيتان الممثلتان بنقاط خضراء متداخلتان ، أكثر وسطا وأماميا للبصلة الشمية. يمكن وضع هذه الحقن بزاوية لطيفة.
يتم تقديم اقتراحات زوايا الإبرة مع مراعاة الوضع البطني للظهارة الشمية ، والتي تقع في الغالب تحت البصلة الشمية. وبالتالي فإن الوصول العمودي مقيد. أدخل الإبرة من خلال الجزء العلوي من تجويف الأنف على بعد حوالي ثلاثة ملليمترات تحت سطح الجلد.
للوصول إلى ظهارة حاسة الشم. يجب أن تشعر اليد المدربة بانخفاض المقاومة عند الوصول إلى المساحة اللمعوية لتجويف الأنف. يجب تجنب هذه المنطقة.
حقن دقيق 0.5 ميكرولتر من محلول مخزون الفيروسات لكل موضع. مرة أخرى ، اختيار موقعين لكل جانب ، كل من اليسار واليمين ، أربع حقن بإجمالي 0.5 ميكرولتر. كل فأر يعني اثنين من ميكرولتر من الفيروس المطلوب لكل فأر في جلسة حقن واحدة.
مرة أخرى ، احرص على عدم حقن بقعة البصلة الشمية لتجفيف أي محلول فيروسي متبقي أو دم قد يهرب من موقع الحقن أو فتحات الأنف. باستخدام منديل الإيثانول ، تخلص من المناديل المبللة في الحاوية المبيضة السائلة المخففة ، ووضع الماوس المحقون على الفور على حاضنة قاع الماء للتعافي. تطهير حقنة الإبرة عن طريق تكرار إجراء التعقيم الذي يتم إجراؤه أثناء التحضير يمكن إعادة الفئران المحقونة إلى قفصها بعد 30 دقيقة من التعافي في حاضنة قاع الماء.
يمكن تكرار هذا الحقن المجهري بالكامل مرة أخرى في غضون أربع ساعات. إذا كنت ترغب في زيادة عدد الخلايا العصبية الحسية الشمية التي ستصاب بالعدوى، فقد يتم تصور الخلايا العصبية الحسية الشمية المصابة طوال طول الخلية في أقل من ثلاثة أيام. تم التضحية بالحيوانات وتشغيلها للمراقبة في النقطة الزمنية المطلوبة.
باستخدام الطرق القياسية من أجل تصور مسارات الخلايا العصبية الحسية الشمية أحادية الخلية المنقولة ومحطة المحور العصبي ، نقوم بتشريح وتقسيم البصلة الشمية الإكليلية بسمك 60 ميكرون. وبالتالي ، سيحتوي القسم على جميع طبقات الخلايا من البصلة الشمية ، بما في ذلك حزم الخلايا العصبية الحسية الشمية ، والمحطات المحورية ، والتي تتشابك في الهياكل الكبيبية المرتبطة بسطح البصلة استعدادا للكيمياء المناعية العائمة. يتم تصنيع المقاطع التسلسلية من البصلة الشمية وتجتاحتها بشكل جماعي في طبق استزراع 10 سم مع خمسة ملليلتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات.
انقل الأقسام العائمة إلى قارورة مخروطية سعة 50 مل. بمجرد أن تستقر الأقسام في قاع القارورة ، قم بتفريغ المحلول الملحي المخزنة بالفوسفات. توخي الحذر حتى لا تنظف بالمكنسة الكهربائية.
يتم تجديد الأقسام الخاصة بك ب 10 مل من المخزن المؤقت الطازج لغسل أي مواد مثبتة أو تضمينية متبقية. قم بإعادة التعليق هذه على الفور في قارورة مخروطية سعة 15 ملليلتر ، مع التأكد من التقاط جميع الأقسام العائمة ، وتفريغ محلول الشطف بالمكنسة الكهربائية ، وتثقيب الأقسام بمحلول 0.3٪ Triton X 100 في محلول ملحي عازل للفوسفات على منصة هزاز لمدة 10 دقائق. في درجة حرارة الغرفة ، يمكنك بعد ذلك المتابعة من خلال بروتوكول تلطيخ مناعي قياسي في نفس القارورة المخروطية ، وتكرار خطوات الفراغ والروك حسب الحاجة لهذا الوعاء بالحجم ، والاحتفاظ بحجم 10 مليلتر لخطوات التلوين والشطف.
فيما يلي قائمة بالأجسام المضادة التي نستخدمها لتلطيخ الخلايا العصبية الحسية الشمية المنقولة إيجابيا ، والخلايا العصبية الحسية الشمية العامة. من أجل اختراق شامل للأجسام المضادة لأقسام المصباح 60 ميكرون ، يوصى باحتضانها طوال الليل عند أربع درجات مئوية. يجب ألا يقل عمق الغسيل عن 20 دقيقة لكل منهما.
انشر كل قسم برفق على شريحة زجاجية باستخدام فرشاة رسم ، كل شريحة مع flora Mount G مع محلول بقع الكروماتين. ابذل جهودا للتخلص من جميع الفقاعات من وسط التركيب. قم بتركيب الأقسام في صفوف لتبسيط خطوة الفحص اللاحقة.
امسح هذه الطبقات على أقسام البصيلة المناعية بحثا عن ألياف المحور العصبي الإيجابي GFP والطرفين. باستخدام المجهر الفلوري ، يمكن بعد ذلك تصوير الأطراف العصبية المصابة بشكل إيجابي بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. من المفيد معايرة المستوى البؤري في مجال اهتمامك باستخدام قنوات بروتين DPI وعلامة حاسة الشم.
تظهر هذه النتائج مستشعر شمي واحد من الألياف العصبية العصبية ومحطة محورية داخل الكبيبة ، وهي ثاني أكسيد الكربون مع بروتين علامة حاسة الشم باللون الأحمر و vlu اثنين في أجسام الخلايا العصبية المستشعرة الشمية المصابة باللون الرمادي ومقبضها الشجيري داخل ظهارة حاسة الشم إذا تم تضمين هذا النسيج في خطوات التشريح والتلوين المناعي. مرحبا ، يوفر لنا الإسقاط متحد البؤر الخاص بي مورفولوجيا مفصلة إلى حد كبير لمسار تمديد محوري خلية عصبية حسية واحدة وشجرة طرفية. يمكن للمرء أن يرى ربط الألياف المحورية مرة أخرى نحو هدفها الكبيبي ، بالإضافة إلى تفاصيل نمطها المتفرع داخل حبوب منع الحمل العصبية الكبيبية.
تسمح طريقة الحقن المجهري للفيروسات بتصور محور عصبي أحادي الخلية ، وأشكال الخلايا العصبية الحسية الشمية ، وتسمح بالدراسات التي تتلاعب بالتعبير الجيني ، ويؤدي نقل الفيروس إلى تكامل جيني مستقر للبنيات. لا يصيب فيروس العدسات الخلايا المجاورة بشكل متشابك. يمكن تحقيق التصور في أقل من ثلاثة أيام وقد تم التأكيد على أنه يستمر لمدة ثلاثة أشهر على الأقل ومن المحتمل أن يستمر لفترات أطول.
لاتصاب الخلايا العصبية الحسية الشمية بسهولة عن طريق التسريب الأنفي لمحلول الفيروسات العدسية. لذلك ، الحقن المجهري من خلال السطح مطلوب في هذا الإجراء. هذا هو إجراء الحقن المجهري للفيروس العدسي لدينا.
آمل أن تكون قد وجدت كل هذه المعلومات مفيدة لتحقيق أشكال الخلية المفردة للصيد السعيد الخاص بك.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة تقنية عدسية جديدة للتلاعب الجيني وتصور محاور الخلايا العصبية الحسية الشمية الفردية وتشجيرها النهائي في الجسم الحي. تتناول هذه الطريقة تحديات دراسة مسارات المحاور الفردية داخل نظام الشم المعقد.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- التلاعب الجيني
- نظام الشم
الخلفية
- تعتبر دراسة التشكلات التغصنية والمحورية على مستوى الخلية الواحدة أمرًا صعبًا.
- ترسل الخلايا العصبية الحسية الشمية محاورها إلى البصلة الشمية، وتشكل حزمًا.
- يعقد هذا التجميع تصور مسارات المحاور الفردية.
- قد لا تعمل الطرق الحالية على عزل وتصور الخلايا العصبية الفردية بشكل فعال.
هدف الدراسة
- تطوير طريقة لتصور الخلايا العصبية الحسية الشمية الفردية في الجسم الحي.
- تعزيز فهم مسارات المحاور والتشكلات النهائية.
- توفير أداة لدراسة نظام الشم على المستوى الخلوي.
الطرق المستخدمة
- حقن دقيق لبنية GFP.
- استخدام الفيروس العدسي للتلاعب الجيني.
- تقنيات التصور في الجسم الحي.
- تحليل أنماط تشجير المحاور والنهايات.
النتائج الرئيسية
- تصور ناجح لمحاور الخلايا العصبية الحسية الشمية الفردية.
- ملاحظة تفصيلية لتشوهات نهايات المحاور.
- تبيين فعالية التقنية العدسية.
- رؤى حول تعقيدات إسقاطات الخلايا العصبية الشمية.
الاستنتاجات
- تعتبر التقنية العدسية أداة قيّمة لأبحاث علم الأعصاب.
- تتيح هذه الطريقة دراسة تشكلات الخلايا العصبية الفردية في الجسم الحي.
- قد تؤدي التطبيقات الإضافية إلى تعزيز فهم نظام الشم.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Precise genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neurons in vivo enables direct interrogation of gene function during neural circuit development. This capability supports mechanistic de-risking and target validation for neurodevelopmental pathways, informing early-stage portfolio decisions. The method's temporal control and single-cell resolution provide predictive confidence for translational neuroscience programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional validation of candidate genes in neural circuit formation at single-cell resolution.
- Supports mechanistic de-risking by linking gene perturbation to axonal morphology and targeting outcomes.
- Facilitates hypothesis-driven studies of molecular pathways underlying sensory neuron development.
Screening & Assay Development
- Provides a platform for quantitative assessment of gene overexpression or knockdown effects in vivo.
- Delivers reproducible visualization of neuronal morphology for assay standardization.
- Enables rapid screening of genetic constructs with observable phenotypic outputs.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by enabling manipulation and tracking of neuronal development in vivo.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by allowing longitudinal studies of gene function.
- Offers predictive value for translational biomarker identification based on morphological phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
This lentiviral microinjection method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging genetic target validation and phenotypic screening in neural systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling direct gene manipulation and morphological readout in olfactory neurons.
- Screening: Provides quantitative, reproducible outputs for evaluating genetic perturbations in vivo.
- Analytics: Delivers high-resolution morphological data for comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Facilitates alignment with disease models by enabling in vivo studies of neuronal development and targeting.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for genetic manipulation and visualization across diverse neural targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in neural development studies.
- Operational Value: Standardizes in vivo genetic manipulation and visualization workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by linking gene function to observable phenotypes in relevant biological systems.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurodevelopmental targets based on functional and morphological evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in in vivo microinjection and biosafety level two procedures.
- Demands access to fluorescence microscopy and confocal imaging infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of injection, staining, and imaging protocols.
- Adaptation may be needed for different neuronal populations or developmental stages.
- Limited to systems where direct microinjection and single-cell visualization are feasible.
