نمذجة سرطان البروستاتا في نماذج الفئران المعدلة وراثيا: تقنية تحرير الجينات الموضعية بوساطة CRISPR / Cas9 في خلايا فص البروستاتا الأمامي للفأر

ابدأ بنموذج فأر مخدر ومجهز CRISPR / Cas9 يحمل جينوم مصمم للتعبير عن نوكليازات Cas9 والبروتينات الفلورية الخضراء ، أو GFPs ، بواسطة مروج قوي في المنبع. يتم إدخال كاسيت FLOXED-STOP أو LSL الذي يتم إدخاله مباشرة في اتجاه مجرى النهر إلى المروج يمنع نسخ Cas9 و GFP في ظل الظروف العادية.

شق جدار بطن الفأر لكشف فص البروستاتا الأمامي المتصل بالحويصلة المنوية. حقن المعلق الغدي المطلوب في الفص الأمامي لتسهيل توصيل الجينوم الفيروسي المستهدف إلى الخلايا. ضع فص البروستاتا مرة أخرى في تجويف البطن وخيط الشق.

داخل الخلايا المصابة بالفيروس ، يعبر الجينوم الفيروسي عن إنزيمات Cre recombinase و RNAs الإرشادية التي تستهدف الجين المراد تحوره. تتعرف إنزيمات Cre على كاسيت LSL وتستأصل مانع النسخ الفلوكس. تسمح هذه الخطوة للمروج بدفع التعبير عن نوكليازات Cas9 و GFPs.

بعد ذلك ، تشكل نوكليازات Cas9 مجمعات مع دليل الحمض النووي الريبي المشفر بالفيروسات والذي يوجه هذه المجمعات إلى التسلسل المستهدف داخل الجين المراد تحوره. يسمح هذا التوطين لنوكيل كلياز Cas9 بشق الحمض النووي الجيني داخل الجين المستهدف ، مما يؤدي إلى تغيير جيني.

يتسبب التغيير الورمي في تحول الخلايا الطافرة إلى سرطانية. يسهل التعبير المشترك لبروتينات مراسل GFP داخل الخلايا الطافرة تحديد وتتبع تطور السرطان.

لتوصيل الفيروس إلى البروستاتا ، بعد تخدير فأر ذكر يبلغ من العمر 8 أسابيع وفقا لبروتوكول النص ، افحص عمق التخدير من خلال تقييم استرخاء العضلات ، وانسحاب الدواسة ، وردود الفعل الجفنية. عندما يلاحظ فقدان ردود الفعل ، احلق أسفل بطن. باستخدام قطعة قطن معقمة ، قم بتغطية عيون بعناية بمرهم بيطري للعيون لمنع العمى الناجم عن جفاف الملتحمة. بعد ذلك ، استخدم 70٪ إيثانول و 10٪ بوفيدون يود لمسح البطن المحلوق لتطهير منطقة الجراحة.

بعد ذلك ، باستخدام مقص جراحي معقم ، قم بعمل شق جلدي عمودي يبلغ طوله 1 سم تقريبا في خط الوسط السفلي للبطن. بعد ذلك ، باستخدام ملقط دقيق ، ارفع الصفاق لمنع إتلاف الأعضاء الموجودة تحتها ، واستخدم المقص الجراحي لعمل شق 8 ملم أو أقصر بعناية عبر الصفاق. حرك الأنسجة الدهنية برفق جانبا للكشف عن الحويصلة المنوية. بعد ذلك ، باستخدام ملقط حلقي ، ارفع الحويصلة المنوية بعناية حتى يمكن التعرف على البروستاتا الأمامية.

الآن ، باستخدام حقنة أنسولين 0.5 مليلتر وإبرة 30 جم × 8 ملم ، قم بحقن حجم إجمالي قدره 30 ميكرولتر من محلول الفيروس في ظهارة البروستاتا الأمامية. قلل من التسرب وتأكد من امتصاص السائل داخل الأنسجة ، مما يشكل فقاعة صغيرة. ثم ضع الحويصلة المنوية مرة أخرى في تجويف البطن.

لضمان امتصاص السائل داخل الأنسجة في فقاعة صغيرة وبدون تسرب ، تأكد من الحقن بالتوازي مع الحويصلة المنوية واتباع شكل فص البروستاتا الأمامي.

باستخدام إبرة مستدقة ودائرة 13 ملم ، 3/8 ، قم بخياطة الصفاق بغرز متقطعة بسيطة من خياطة قابلة للامتصاص 6-0. بعد ذلك ، قم برفع الجلد بالملقط لتجنب إتلاف الصفاق ، وقم بتدبيس الجلد بثلاثة مشابك معقمة مقاس 4.8 × 6.5 ملم.

للتعافي بشكل أفضل بعد الجراحة ، استخدم حقنة معقمة سعة 1 مليلتر وإبرة 27 جم × 1/2 بوصة لإدارة ترياق التخدير بجرعة 0.1 مل لكل جرام من وزن الجسم عن طريق الحقن داخل الصفاق. ثم ضع بعناية في قفصه.

• CRISPR/Cas9 knock-in mouse model - Genetically engineered rodent model used for research purposes involving the CRISPR/Cas9 genome editing system.
• Lsl cassette - A genetic construct used to block transcription under certain conditions.
• Cas9 endonucleases - Enzymes expressed by the Cas9 gene, used in CRISPR for cutting DNA at desired locations.
• Green Fluorescent Proteins (GFPs) - Proteins that glow green under specific light; used as a marker in biological research.
• Prostate Cancer Model - A mouse model designed for prostate cancer studies.

• Introduce CRISPR/Cas9 knock-in mouse model – Define and contextualize the genetically engineered rodent model utilized for genome editing research (e.g., mouse models of prostate cancer).
• Key Concepts – Summarize principles of genetic editing using concepts like lsl-cassette, Cas9 endonucleases, and GFPs (e.g., targeted viral genome delivery).
• Underlying Mechanisms – Briefly describe the process of creating a genetic mutation (e.g., Cre recombinase enzymes and guide-RNA).
• Connect to Experiment – Discuss the importance of these processes in creating prostate cancer mouse models, demonstrating genetic alteration and cancer progression.

• What is the CRISPR/Cas9 knock-in mouse model and how does it assist in genetic research?
• How does the incorporation of GFPs help in tracing cancer progression?
• What is the role of Cas9 endonucleases in the genetic mutation process?

• Practical Applications – Discuss real-world use cases of these techniques in genetic research and cancer study (e.g., prostate cancer research).
• Industry Impact – Identify research sectors benefiting from mouse models, including genome science, biotechnology, and healthcare (e.g., CRISPR technology).
• Societal Importance – Emphasize the wider benefits of this technology, in aiding our understanding of diseases and therapies (e.g., cancer research).
• Link to Scientific Advancements – Discuss the significant breakthroughs these models have led to in scientific research.