موسوعة JoVE للتجارب
أبحاث السرطان
0 مشاهدة • 3:56 دقيقة • April 30th, 2023
للبدء ، قم بإعداد أنثى فأرة مخدرة في وضع الاستلقاء. تأكد من أن مثانتها فارغة تماما. من خلال فتحة مجرى البول ، أدخل قسطرة مشحمة. يساعد التشحيم في ممر مجرى البول السلس للدخول إلى المثانة.
بعد القسطرة ، قم بعمل شق في البطن وتشريح العضلات الداخلية لكشف المثانة. بعد ذلك ، قم بتعليق بلازميدات الحمض النووي الممزوجة بصبغة مناسبة في الطرف الخارجي للقسطرة. ترد بلازميدات الحمض النووي هذه لجين مراسل الفلورسنت.
قم بتوصيل حقنة بالقسطرة وادفعها لتوصيل محلول البلازميد إلى المثانة. تقوم جزيئات الصبغة المحقونة بتلوين المثانة ، مما يؤكد الإدارة الناجحة لمحلول البلازميد. قم بإزالة مجموعة القسطرة وشد فتحة مجرى البول الخارجية لمنع تدفق محلول البلازميد للخارج.
الآن ، اضغط على المثانة باستخدام قطبين متصلين بمولد التثقيب الكهربائي. تطبيق نبضات كهربائية ذات جهد مناسب للفترة المرغوبة على المثانة. يؤدي تعرض ظهارة المثانة ، البطانة الأعمق للمثانة ، إلى المجالات الكهربائية المطبقة إلى مسام مؤقتة في غشاء الخلية البولية.
تسمح نفاذية الغشاء المتزايدة بالتوصيل الفعال لبلازميدات الحمض النووي المحقونة إلى الخلايا. بعد التثقيب الكهربائي ، قم بخياطة الشق الجراحي. اسمح للماوس بالتعافي. تعبر الخلايا البولية المنقولة ببلازميدات الحمض النووي عن بروتينات مراسل الفلورسنت.
لكل مثانة تقوم بتعدادها ، قم بإعداد ما لا يقل عن 20 ميكرولترا من بلازميد الحمض النووي بمعدل 1 ميكروغرام لكل ميكرولتر. بعد ذلك ، أضف 1 ميكرولتر من Trypan Blue إلى 20 ميكرولترا من محلول البلازميد في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مليلتر وماصة لخلطها جيدا. لتوصيل البلازميد ، ضع 70٪ من الإيثانول على البطن. قم بعمل شق عمودي بطول 1 سم لفتح جلد البطن فوق المثانة.
بعد ذلك ، قم بقطع طبقة العضلات لفضح المثانة. ضع الماصة ما لا يقل عن 20 ميكرولترا من البلازميد بالإضافة إلى محلول Trypan Blue في الطرف الخارجي للقسطرة وقم بتثبيتها بالمحقنة. ثم حقن محلول البلازميد في المثانة. إذا تحولت المثانة إلى اللون الأزرق ، يكون الحقن ناجحا. اترك بعض السوائل في القسطرة لتجنب تكوين فقاعات هواء في المثانة.
بعد ذلك ، أمسك فتحة مجرى البول الخارجية وقم بإزالة القسطرة والحقنة. استخدم خيطا لشد فتحة مجرى البول الخارجية. اصنع حلقتين بالخيط ثم اربطه بعقدتين. هذه خطوة حاسمة تتطلب من شخصين التعاون. تأكد من إحكام العقد حتى لا تتسرب البلازميدات.
الآن ، قم بتشغيل مولد التثقيب الكهربائي. اضغط على المثانة بقطبين كهربائيين وادفع دواسة القدم لإجراء التثقيب الكهربائي. للحفاظ على المثانة مدعومة ، يمكن للمرء أن يقرص الجزء الخلفي من شق البطن بالملاقط. تجنب أي ملامسة بين الملقط والأقطاب الكهربائية ، فقد يؤدي ذلك إلى حدوث شرارة.
عند الانتهاء ، قم بخياطة فتحة البطن والجلد بخياطة جراحية معقمة. قم بإزالة السلسلة وتطبيق المقاطع. ضع اليود على الجرح ثم قم بإزالة من نظام الأيزوفلوران. تطبيق مسكن البوبرينورفين تحت الجلد لتخفيف آلام ما بعد الجراحة. احتفظ بالحيوان على وسادة التدفئة وأعده إلى قفص المنزل بعد الشفاء التام.