إزالة التصبغ وتلطيخ كلى الزرد: تقنية لتحضير كلية الزرد البالغة للتلطيخ

كلية الزرد البالغة هي بنية شفافة تقع بجوار جدار الجسم الظهري للسمكة. تظهر الكلى وجود بقع سوداء سطحية تتوافق مع الخلايا الصباغية المتناثرة - الخلايا المتخصصة التي تحمي الخلايا الجذعية للكلى من الأشعة فوق البنفسجية الضارة.

لإزالة التصبغ وإعداد الكلى للتلوين ، ابدأ بتناول سمكة الزرد البالغة القتل الرحيم. اغمر سمك الزرد كله في محلول مثبت مناسب واحتضانه للمدة المطلوبة. تسمح الحضانة للمحلول المثبت باختراق جسم السمكة وقفل مكونات الأنسجة في مكانها.

بعد ذلك ، ضع سمك الزرد بطنيا وأزل رأسه. قم بعمل شق بطني طويل يبدأ تحت منطقة الرأس ويمتد حتى الزعنفة الذيلية. قم بإزالة الأعضاء لكشف الكلية الأساسية. باستخدام الملقط ، افصل الكلية عن الجدار الظهري وضعها في قارورة زجاجية.

عالج الكلى المقطعة بتركيز متزايد من محلول السكروز. يخلق محلول السكروز بيئة متساوية التوتر تمنع انكماش الكلى. بعد ذلك ، احتضان الكلى في محلول تبييض لإزالة تصبغ الخلايا الصباغية. هذا يساعد في تصور الكلى بشكل أفضل أثناء إجراءات التلوين الإضافية.

أخيرا ، استبدل محلول التبييض بمحلول مانع لمنع المواقع غير المرغوب فيها ومنع أي تلطيخ غير محدد. كلية الزرد البالغة منزوعة الصبغة جاهزة الآن لخطوات التلوين اللاحقة.

عندما تصبح جاهزا ، استخدم ملقطا دقيقا لفصل الكلية بعناية عن جدار الجسم الظهري ووضع العضو في قارورة زجاجية. اغسل الكلية المقطوعة ثلاث مرات باستخدام 3 إلى 5 ملليلتر من 1x PBS مع 0.05٪ توين لمدة 5 دقائق لكل منهما.

بعد ذلك ، قم بإزالة محلول PBS وشطف الكلى ب 3 ملليلتر من محلول السكروز بنسبة 5٪ لمدة 30 دقيقة. بعد هذا الوقت ، استبدل المحلول ب 3 ملليلتر من السكروز بنسبة 30٪ واحفظه طوال الليل عند 4 درجات مئوية.

في اليوم التالي ، قم بإزالة المحلول وغسل الكلية مرتين قبل إضافة 3 إلى 5 ملليلتر من محلول التبييض لإزالة تصبغ الخلايا الصباغية الموجود على عضو الكلى. ضع القارورة الزجاجية على دوار وراقب بعناية حتى يختفي التصبغ. يستغرق إزالة التصبغ عادة حوالي 20 دقيقة ولكن في بعض الأحيان قد يستغرق ما يصل إلى 60 دقيقة.

إذا ترك محلول التبييض لفترة طويلة ، يمكن أن يحدث التفكك ، وبالتالي ينصح بمراقبة العينة كل 10 إلى 15 دقيقة للتحقق من سلامة الأنسجة. عندما تتم إزالة التصبغ من الكلى ، اغسلها مرتين واحتضانها بمحلول 4٪ PFA لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، قم بإزالة محلول PFA بنسبة 4٪ واغسل الكلى ثلاث مرات. بعد الغسيل الأخير ، أضف 3 إلى 5 ملليلتر من محلول المنع واحتضان الكلى في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. عند اكتمال الحجب ، انتقل مباشرة إلى بروتوكول التلوين المحدد.