موسوعة JoVE للتجارب
التقنيات البيولوجية
0 مشاهدة • 3:11 دقيقة • July 8th, 2025
الفيروس المؤتلف المرتبط بالغدة ، rAAV ، هو فيروس DNA صغير أحادي الشريطة تم تصميمه وراثيا لاستهداف نوع معين من الخلايا ونقل حمولته الجينية إلى نواة الخلية المضيفة للتعبير الجيني.
ابدأ بتقييد جرو فأر مخدر بالتبريد. تعقيم الجلد الخلفي وحقن ناقل rAAV تحت الجلد الذي يحمل الجين المعدل المطلوب على طول محفز خاص بالقلب. يتم امتصاص الناقل في الأوعية الدموية ويصل إلى الأعضاء البعيدة ، بما في ذلك القلب.
هنا ، يرتبط الفيروس المؤتلف بسطح خلية عضلة القلب ويتم استيعابه عن طريق الالتقام الخلوي في جسيم داخلي. داخل الجسيم الداخلي ، تتفكك القفيصة الفيروسية جزئيا ، مما يكشف عن البروتينات اللايتية الفيروسية. يحفز هذا البروتين المسام في الغشاء الداخلي ، والذي من خلاله يهرب الناقل إلى السيتوبلازم.
ينتقل الناقل عبر الأنابيب الدقيقة السيتوبلازمية ويدخل من خلال المسام النووية. بمجرد دخوله إلى النواة ، يتم تفكيك القفيصة الفيروسية لإطلاق جينومها. ثم يتم تحويل الحمض النووي أحادي الشريطة الذي يحمل الجين المستهدف إلى حمض نووي مزدوج الشريطة.
بعد نسخ الحمض النووي ، ينتقل mRNA المنتج إلى السيتوبلازم. هنا ، يخضع mRNA للترجمة ، معبرا عن البروتين المستهدف في خلايا عضلة القلب. راقب عينات الأنسجة من أعضاء مختلفة تحت المجهر الفلوري لتحديد كفاءة وخصوصية الأنسجة لتوصيل الجين إلى القلب.
بعد تحديد العيار الفيروسي وفقا لبروتوكول النص ، قم بإعداد حلول عمل rAAV9 مع عيار الفيروس من 1-7 × 1012 جسيما لكل مليلتر. لعلاج الفئران حديثي الولادة ، استخدم محلول rAAV9 لملء حقنة الأنسولين 0.33 × 12.7 مليلتر بإبرة قياس 29 بوصة 1/2 بوصة ، وتجنب فقاعات الهواء.
بعد تجميد الجرو ، أمسك الجرو بيد واحدة بالإبهام والسبابة. بعد ذلك ، اسحب الجلد الخلفي للجرو بعصا مسحة مشبعة بكحول الأيزوبروبيل بنسبة 70٪. أدخل إبرة المحقنة في الجزء السفلي الأمامي الظهري للحيوان بزاوية من 5 إلى 10 درجات قبل حقن 50 إلى 70 ميكرولترا من محلول rAAV9.