تلطيخ الخلايا بالحمض الدوري: تقنية في المختبر للكشف عن مستويات الجليكوجين في خلايا الدم المحيطية أحادية النواة

خلايا الدم المحيطية أحادية النواة ، أو PBMCs ، هي خلايا دم الدورة الدموية ذات النوى المفردة الكبيرة ، والتي تتكون من الخلايا الليمفاوية B و T ، والخلايا القاتلة الطبيعية ، والخلايا الوحيدة ، والخلايا المتغصنة. تخزن PBMCs فائض الجلوكوز في شكل بوليمري مثل الجليكوجين - عديد السكاريد المتفرع - في السيتوبلازم.

للكشف عن وجود الجليكوجين في PBMCs ، قم بإعداد مسحة موحدة من PBMCs المعزولة على شريحة زجاجية. عالج الخلايا بالفورمالين - محلول مثبت يربط الجزيئات الحيوية الخلوية ، ويحافظ على السلامة الهيكلية ل PBMCs.

اغمر الشريحة جزئيا في محلول الأميليز. يدخل هذا الإنزيم إلى الخلايا ويتحلل الجليكوجين في الخلايا المعالجة. ينتج عن هذا مجموعتين متميزتين من الخلايا - الخلايا المعالجة بالإنزيم ، ونقص الجليكوجين ، والخلايا الغنية بالجليكوجين غير المعالجة بالأميليز.

قم بتراكبها بمحلول حمضي دوري يحول مجموعات الهيدروكسيل من جزيئات الجليكوجين إلى ألدهيدات.

اشطف الشريحة بالماء لوقف تفاعل الأكسدة وإزالة الحمض الدوري الزائد. عالج الشريحة باستخدام كاشف شيف ، الذي يتفاعل مع مجموعات الألدهيد من الجليكوجين الدوري المعالج بالحمض ، مما ينتج عنه مركب غير قابل للذوبان بلون أرجواني.

قم بتطبيق وسائط التركيب لكبح الخلايا أثناء التصوير. ضع غطاء لنشر وسائط التثبيت على سطح الشريحة بالكامل للحصول على تصور أفضل. تخيل الخلايا الملطخة.

الخلايا غير المعالجة بالأميليز على حبيبات جليكوجين أرجوانية غائبة في الخلايا المعالجة بالإنزيم.

في هذه الخطوة ، ضع الشريحة على سطح مستو. ضع 2 مل من محلول الحمض الدوري على العينة ، واحتضنه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم اشطف الشريحة عدة مرات بالماء المقطر. ضع 2 مل من كاشف شيف على الشريحة ، واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.

بعد ذلك ، اغسل الشريحة بالماء المقطر لمدة 5 دقائق ، ثم اتركها لتجف في الهواء. بعد ذلك ، قم بتطبيق 100 ميكرولتر من وسائط التثبيت على الشريحة ، وقم بتغطيتها بغطاء واحد كبير ، أو ضع 50 ميكرولترا واستخدم غطاءين صغيرين. بعد ذلك ، ضعي طلاء أظافر شفاف على حواف الغطاء. دعهم يجفوا طوال الليل.

بعد ذلك ، احصل على صور باستخدام مجهر الضوء المجهر باستخدام هدف 100X.