الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء ذات المرحلة العكسية: طريقة قوية لتقدير كمية أحماض السياليك المصنفة والمشتقة من الفلورسنت المعزولة من كبد الفأر

أحماض السياليك ، مثل حمض N-acetylneuraminic وحمض N-glycolylneuraminic ، عبارة عن شقوق كربوهيدرات سالبة الشحنة توجد في النهايات البعيدة لسلاسل قليل السكاريد على سطح خلية الثدييات.

لتحديد الكميات النسبية من أحماض السياليك هذه في أنسجة كبد الفأر باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء ذات الطور العكسي أو RP-HPLC ، أولا ، قم بمعالجة خليط حمض السياليك المعزول بعامل اشتقاق. يتفاعل عامل الاشتقاق مع المجموعات الوظيفية لأحماض السياليك ، مما يولد مشتقات حمض السياليك الفلورية المستقرة.

قم بتجميع عمود RP-HPLC ، متصل بكاشف الفلورة. يتكون العمود من طور ثابت مسامي قائم على السيليكا مرتبطة بروابط سلسلة الألكيل غير القطبية الكارهة للماء لتسهيل التفاعلات الانتقائية مع مشتقات حمض السياليك أثناء التشغيل الكروماتوجرافي.

قم بموازنة العمود باستخدام الطور القطبي المائي المتحرك الذي يحتوي على تركيزات منخفضة من الأسيتونيتريل ، وهو مذيب عضوي أقل قطبية ، لتكييف العمود الأمثل.

قم بتحميل خليط حمض السياليك المشتق في العمود.

يمتص حمض N-acetylneuraminic ، الذي يحتوي على مجموعة N-acetyl الكارهة للماء ، بقوة أكبر إلى الروابط الكارهة للماء في المرحلة الثابتة من حمض N-glycolylneuraminic مع مجموعة N-glycolyl المحبة للماء.

قم بتحليل العينات باستخدام نظام HPLC قياسي متصل بكاشف مضان عبر الإنترنت. استخدم عمود C-18 عكسي الطور بطول 250 ملم وقطر 4.6 ملم للتحليل.

بعد تحضير المذيب A والمذيب B ، وإعداد تشغيل HPLC كما هو مفصل في بروتوكول النص ، قم بحقن 50 ميكرولترا من العينة في نظام HPLC.

مراقبة المواد المزيئة، باستخدام الطول الموجي لإثارة كاشف التألق البالغ 373 نانومتر، وطول موجة انبعاث يبلغ 448 نانومتر.

أخيرا ، احسب الكمية النسبية ل Neu5Gc كما هو موضح في بروتوكول النص.