هيكل HIV - 1 بواسطة جمعيات قفيصة البرد المجهر الإلكتروني وتكرارية حلزوني الإعمار الحقيقي الفضاء

الهدف العام من هذا الإجراء هو توفير طريقة للحصول على بنية ثلاثية الأبعاد للجزيئات المجمعة لولبيًا باستخدام المجهر الإلكتروني المبرد. يبدأ البروتوكول بتحضير عينة المجهر الإلكتروني المبرد باستخدام طريقة التخفيف السريع والتجفيف من الجهة الخلفية لتقليل تركيز الملح مؤقتًا عند تحضير شبكة المجهر الإلكتروني المبردة والمرطبة. تضمن هذه العملية استقرار البروتين مع تقليل الضجيج في الخلفية وتحسين نسبة الإشارة إلى الضجيج أثناء جمع البيانات بجرعة منخفضة بالمجهر الإلكتروني المبرد الذي يلي عملية جمع البيانات.

تم الانتهاء من الفهرسة الحلزونية لأنماط الحيود. ثم يتم إجراء معالجة الصور، تليها إعادة بناء ثلاثية الأبعاد في الفضاء الحقيقي، مما يؤدي إلى الحصول على خريطة الكثافة النهائية للقفيصة الواحدة لفيروس HIV أو أنبوب ca. وبوجه عام، سيواجه الأفراد الجدد في هذه الطريقة صعوبات نظراً لوجود عدة نقاط حرجة لجمع البيانات وتحليلها بشكل أمثل.

على سبيل المثال، في حالة فيروس HIV، تتشكل تجميعات أنبوبية من القفيصة (capsid) فقط في محلول مصدري بتركيز 1 molar، حيث ينخفض تركيز الملح بسرعة دون التأثير على البنية. ومن الضروري للغاية الحصول على صور عالية الجودة باستخدام المجهر الإلكتروني المبرد (cryo EM). وعند توفر صورة لأنبوب، يكون من الصعب جداً معرفة كيفية فهرسة أنبوب حرج، وتحديد البرنامج الذي يمكن استخدامه لإجراء إعادة البناء ثلاثي الأبعاد (3D reconstruction).

يوفر هذا الفيديو نهجاً مفصلاً ومبسطاً للحصول على إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للأجسام المادية، ويمكن استخدامه كمرجع لتجربتك. سأقوم باستعراض الإجراء مع الدكتورة Puja. كلانا باحثان في مرحلة ما بعد الدكتوراه من مختبر Dr.Laboratory. لتحضير تجمعات بروتين القفيصة HIV-1 من أجل المجهر الإلكتروني المبرد cryo EM، ابدأ بتفريغ الشحنة بالتوهج للجانب الكربوني لشبكات النحاس ذات المسامية 200 mesh تحت تيار 25 milliamps لمدة 25 ثانية.

استخدم جهاز ترذيذ لرفع الرطوبة إلى 80% في غرفة البيئة، وهي عبارة عن مكبس جاذبية يدوي الصنع. وفي هذه الأثناء، قم بتبريد الإيثان، السائل، في أداة دفع زجاجية باستخدام النيتروجين السائل، ثم ثبت أداة التجميد بالدفع على مكبس الجاذبية اليدوي. بعد ذلك، استخدم ملقطاً لإغلاق القابضات بإحكام على حافة الشبكة.

ضع 2.5 µL من محلول بروتيني مُحضَّر مسبقاً على الجانب الكربوني من الشبكة. بعد ذلك، ثبّت الشبكة باستخدام الملقط على المكبس بحيث يكون الجانب الكربوني موجهاً للخارج. أضف 3 µL من محلول تخفيف منخفض الملوحة إلى الجانب الخلفي من الشبكة.

قم بتجفيف الشبكة فوراً باستخدام قطعة من ورق الترشيح على نفس الجانب. حافظ على تلامس كامل السطح الخلفي للشبكة مع ورق الترشيح لمدة ست ثوانٍ تقريباً. بعد إزالة ورق الترشيح، اغمر الشبكة فوراً في الإيثان السائل.

أخيراً، أزل الملقط من المكبس وانقل الشبكة بسرعة إلى صندوق تخزين الشبكات. ابدأ عملية المجهر الإلكتروني المبرد عن طريق تحميل الشبكة المبردة والمرطبة في مجهر إلكتروني من طراز FEI polar G two، والذي يعمل بجهد 200 kilovolts ومجهز بكاميرا gatin 4K by 4K CCD.

في وضع البحث بجرعة منخفضة، أضف تكبيراً بنسبة 200 x تقريباً. افحص الشبكة بأكملها بحثاً عن المناطق التي تحتوي على جليد مناسب. احفظ مواقع هذه المناطق في ملف المنصة.

استرجع المواقع المحفوظة وقم بفحص هذه المناطق بشكل أدق. أضف تكبيراً بمقدار 3,900 x في وضع البحث بجرعة منخفضة. اختر المناطق ذات الطبقة الجليدية الرقيقة والمتجانسة لجمع البيانات، والتي تتميز باحتوائها على أنابيب طويلة معلقة فوق ثقب.

احفظ جميع المناطق في ملف المرحلة الثانية. انتقل إلى وضع التعريض. أضف تكبيراً بمقدار 59,000 x وقم بتركيب فتحة عدسة شيئية بحجم 100 micrometer.

بعد ذلك، اضبط تصحيح اللامركزية (stigmatism) للعدسة وكثافة الحزمة لتحقيق جرعة تبلغ حوالي 15 إلكتروناً لكل أنجستروم مربع لكل تعريض. عُد إلى وضع البحث منخفض الجرعة وانتقل إلى موضع محفوظ. قم بتحديد أنبوبة مناسبة ووضعها في المركز.

باستخدام كاميرا CCD، انتقل إلى وضع التركيز، وقم بضبط البؤرة وتحديد قيمة إزاحة التركيز (defocus) التي تتراوح عادةً بين 0.5 و 2.5 micrometers. ثم انتقل إلى وضع التعريض الضوئي واضبط زمن التعريض من 0.3 إلى 0.5 seconds للحصول على جرعة قدرها 15 electrons per angstrom squared. اجمع الصور باستخدام كاميرا لوحية، مع ترك الأفلام تستقر لمدة 10 seconds قبل إجراء التعريض.

بعد جمع الصور، انتقل إلى الموضع المحفوظ التالي وكرر هذه العملية لجمع المزيد من الصور. قم بتحميض الأفلام في محلول D 19 بتركيزه الكامل لمدة 12 دقيقة. ثم قم برقمنة الصور باستخدام ماسح ضوئي Nikon Super cool scan 9, 000 ED بحجم بكسل 6.35 micrometers.

يمكن فهرسة الجسم الحلزوني باستخدام معلمين اثنين: رتبة Bessel N ورقم خط الطبقة L في تحويل فوريه للشبكة السطحية للجسم الحلزوني. يتم تمييز كل خط طبقة بواسطة N وL، وهو يقابل مجموعة من الخطوط على الشبكة السطحية كما يشار إليها بمؤشرات H وK.

لبدء الفهرسة الحلزونية، استخدم برنامج Helix boxer من حزمة Iman لتحديد أنبوب مستقيم وطويل نسبياً وذي قطر منتظم، ثم احفظ الصورة بصيغة MRC. بعد ذلك، قم بقياس نصف قطر الأنبوب باستخدام برنامج boxer من حزمة Iman. حدد مسافة التكرار الحلزوني (HEL) باستخدام برنامج يعتمد على الارتباط المتبادل مثل I-M-G-C-C-F الموجود في حزمة MRC.

احسب بعد ذلك foyer. قم بالتحويل باستخدام طول صندوق جديد يكون مضاعفاً صحيحاً لمسافة التكرار. بعد ذلك، اختر خطي طبقة رئيسيين يحددان متجهي شبكة سطحية أساسيين هما (1، 0) و (0، 1) بوحدات بكسل FFT.

حدد أرقام خطوط الطبقات بالإضافة إلى أنصاف أقطار السعة القصوى لخطوط الطبقات الرئيسية الاثنين في تحويل فوريه. وبناءً على أرقام خطوط الطبقات وقيم رتب Bessel لخطوط الطبقات الرئيسية الاثنين، يمكن الحصول على الدوران بين الوحدات الفرعية والارتفاع المحوري للولب النجمة الواحدة باستخدام قاعدة الاختيار كما هو موضح في الإجراء المكتوب. يصف هذان الرقمان الحقيقيان التماثل اللولبي للأنبوب.

تبدأ عملية إعادة البناء ثلاثية الأبعاد بتجزئة الجسيمات باستخدام برنامج Iman.Boxer. بعد فتح صورة مجهرية تحتوي على جسيمات لولبية، قم بتقطيع الجسيم إلى أجزاء متداخلة في لوحة التحكم الخاصة ببرنامج boxer. اختر وضع الحلزون (helix mode) وقم بتحديد معاملات التأطير (boxing).

يجب أن يكون حجم الصندوق أكبر من قطر الجسيم، كما يجب أن تكون قيمة OLA حوالي 90% من حجم الصندوق. بعد ذلك، سيؤدي النقر على أي طرف من صندوق الجسيم إلى إنشاء سلسلة من صناديق الجسيمات تلقائياً على طول اللولب، وحفظ القطع المحددة في الصناديق بالإضافة إلى إحداثياتها. الخطوة التالية هي إجراء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد أولية باستخدام طريقة إعادة البناء التكرارية للولب في الفضاء الحقيقي I-H-R-S-R قبل المعالجة باستخدام I-H-R-S-R.

اعكس تباين صور المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM) وقم بتطبيق ترشيح LOWPASS. ثم افتح الواجهة الرسومية لبرنامج I-H-R-S-R عن طريق كتابة generator. زوّد الواجهة الرسومية بجميع المعلومات الخاصة بمجموعة الجسيمات المؤطرة (boxed particles stack)، بما في ذلك اسم ومسار المجموعة، وعدد الصور الموجودة فيها، وقيم معاملات التماثل.

انقر فوق زر الإنهاء لإنشاء نص إعادة البناء البرمجي. B 25 SP.I استخدم أسطوانة صلبة أو مجوفة كمرجع أولي واترك الإجراء يدور في حلقات حتى لا تطرأ أي تغييرات في تماثل اللولب المحدد، وهو ما يحدث عادةً بعد بضع دورات. ومن المفترض أن يؤدي تماثل اللولب اليميني إلى إعادة بناء متقاربة ومستقرة.

سيتم استخدام عملية إعادة البناء الناتجة في الدورة الأخيرة كمرجع أولي لمزيد من التحسين. وأخيراً، قم بإجراء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد مع تحسين تكراري باستخدام خريطة الكثافة ثلاثية الأبعاد الناتجة عن I-H-R-S-R كمرجع أولي لتحسين إضافي أثناء عملية التحسين. يتم تثبيت التناظر الحلزوني عند الدوران بين الوحدات الفرعية والارتفاع المحوري، واللذين يتم تحديدهما من إجراء I-H-R-S-R.

بعد ذلك، يتم تحديد قيمة فقدان التركيز (defocus) واللابؤرية (astigmatism) الموجودة في المجهر الضوئي باستخدام برنامجي CTFFIND3 و CTFtilt ضمن حزمة برامج SPIDER التي تسمى FT و mu، ثم تُضرب قطع الجسيمات في دالة نقل التباين (contrast transfer function)، والتي يُرمز لها اختصاراً بـ CTF. يتم إجراء مطابقة الإسقاط من خلال مقارنة إسقاطات الأحجام المرجعية بالصور المصححة وفقاً لـ CTF باستخدام محاذاة متعددة المراجع. يتم حصر التباين في زاوية الميل خارج المستوى ضمن نطاق زائد أو ناقص 10 درجات، ويتم أخذ عينات منها بخطوات قدرها درجة واحدة؛ كما يتم وضع قيود مثل معاملات ارتباط عالية في الزوايا المستوية القريبة من صفر درجة أو 180 درجة، وإزاحات محدودة في محور X.

بالنسبة لمعلمات المحاذاة لكل شريحة، قم بتضمين الشرائح التي تستوفي القيود فقط في عملية إعادة البناء. بعد كل دورة تحسين تكرارية، يتم إنشاء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد باستخدام الإسقاط الخلفي والقسمة على مربع CTF، ثم يُطبق التناظر الحلزوني لإنشاء حجم متناظر. تنتهي عملية التحسين التكرارية عندما لا يحدث أي تحسن إضافي في دقة إعادة البناء ثلاثية الأبعاد الجديدة.

تم تحديد تجميع كبسيدة واحدة من فيروس HIV-1، وهي عبارة عن أنبوب 92 e، وحساب تحويل فوريه لها لفهرسة الحلزون لتقدير النصف قطرين، وتم تحديد أرقام خطوط الطبقة وأنصاف أقطار السعة القصوى لخطوط الطبقة 10 و01. بعد ذلك، حُسبت قيم نهائية قدرها -12 و11 لكل من 10 و01 على التوالي، مع مسافة تكرار بلغت 5195.48 angstroms. تم تحديد التماثل اللولبي للأنبوب حيث كانت delta Z تساوي 6.81 angstroms وdelta five تساوي 328.88 درجة، ثم نُقحت قيم delta Z وdelta five لتصبح 7.13 angstroms و328.86 درجة باستخدام I-H-R-S-R، وتم إنشاء إعادة بناء أولية بعد 10 دورات تكرارية.

أدى إعادة البناء النهائية بعد الصقل التكراري إلى تحسين خريطة الكثافة بشكل ملحوظ مقارنة بالنموذج الأولي الذي تم حسابه باستخدام I-H-R-S-R. يتم عرض خريطة الكثافة لأنابيب تجميع القفيصة كـثلاث شرائح متعامدة: موازية لمحور الأنبوب وقريبة من السطح، وعمودية على محور الأنبوب، وموازية لمحور الأنبوب ومارة عبره. ينتج الهيكل المعروض من التصيير السطحي لخريطة الكثافة ثلاثية الأبعاد المحددة عند 1.8 Sigma والتي تشمل 100% من الحجم.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد جداً لكيفية الحصول على بنية ثلاثية الأبعاد لجزيء مجمع باستخدام المجهر الإلكتروني المبرد.