هيكل HIV - 1 بواسطة جمعيات قفيصة البرد المجهر الإلكتروني وتكرارية حلزوني الإعمار الحقيقي الفضاء

الهدف العام من هذا الإجراء هو توفير طريقة للحصول على بنية ثلاثية الأبعاد للجزيئات المجمعة من طائرات الهليكوبتر باستخدام المجهر الإلكتروني بالتبريد. يبدأ البروتوكول بتحضير عينة cryo EM باستخدام طريقة التخفيف السريع والنشاف الخلفي لتقليل تركيز الملح بشكل عابر عند تحضير شبكة EM الرطبة المجمدة. تضمن هذه العملية استقرار البروتين مع تقليل ضوضاء الخلفية وتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء أثناء جمع بيانات الجرعة المنخفضة من cryo EM التي تتبع بعد جمع البيانات.

اكتمل الفهرسة الحلزونية لمخططات الحيود. ثم يتم إجراء معالجة الصور ، متبوعا بإعادة بناء ثلاثية الأبعاد للفضاء الحقيقي ، مما ينتج عنه خريطة الكثافة النهائية لفيروس نقص المناعة البشرية قفيصة واحدة أو أنبوب كاليفورنيا. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن هناك العديد من النقاط الحاسمة لجمع البيانات وتحليلها على النحو الأمثل.

على سبيل المثال ، في حالة فيروس نقص المناعة البشرية ، تجميعات أنبوبية قفيصة واحدة تتشكل فقط في محلول مصدر مولي واحد يقلل بسرعة من تركيز الملح دون التأثير على الهيكل. من الأهمية بمكان الحصول على صور EM بالتبريد عالية الجودة. بالنظر إلى صورة الأنبوب ، من الصعب جدا معرفة ما يجب فعله لفهرسة أنبوب حرج والبرامج التي يمكن اعتبارها للقيام بإعادة بناء ثلاثية الأبعاد.

يوفر هذا الفيديو نهجا مفصلا ومباشرا للحصول على إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للأشياء المادية ويمكن استخدامه كمرجع لتجربتك. سأعرض الإجراء مع Dr.Puja. كلانا باحث ما بعد الدكتوراه من Dr.Laboratory لإعداد تجميعات بروتين القفيصة لفيروس نقص المناعة البشرية بالتبريد تبدأ بالتوهج ، وتفريغ جانب الكربون من 200 شبكة نحاسية تحت 25 مللي أمبير لمدة 25 ثانية.

استخدم البخاخات لرفع الرطوبة إلى 80٪ في الغرفة البيئية ، وهي عبارة عن مكبس جاذبية يدوي محلي الصنع. وفي الوقت نفسه ، يقوم الإيثان السائل البارد في عامل الغطاس المختبري مع النيتروجين السائل بتركيب عامل تجميد الغطس على مكبس الجاذبية اليدوي. بعد ذلك ، استخدم الملقط لتثبيت الكماشة المغلقة على حافة الشبكة.

ضع 2.5 ميكرولتر من محلول البروتين المجمع مسبقا على جانب الكربون من الشبكة. ثم قم بتحميل الملقط على المكبس بحيث يكون الجانب الكربوني من الشبكة متجها بعيدا. أضف ثلاثة ميكرولترات من المخزن المؤقت منخفض التخفيف للملح إلى الجانب الخلفي من الشبكة.

امسح الشبكة على الفور بقطعة من ورق الترشيح على نفس الجانب. حافظ على السطح الخلفي للشبكة بالكامل على اتصال وثيق بورق الترشيح لمدة ست ثوان تقريبا. بعد إزالة ورق الترشيح ، اغمر الشبكة على الفور في الإيثان السائل.

أخيرا ، قم بإزالة الملقط من المكبس وانقل الشبكة بسرعة إلى صندوق تخزين شبكي. ابدأ المجهر الإلكتروني بالتبريد عن طريق تحميل الشبكة الرطبة المجمدة في مجهر إلكتروني قطبي G ثنائي FEI. تعمل بقوة 200 كيلو فولت ومجهزة بكاميرا جاتين 4K × 4K CCD.

في وضع البحث عن جرعة منخفضة ، أضف تكبيرا يبلغ حوالي 200 ×. قم بفحص الشبكة بأكملها بحثا عن المناطق ذات الجليد المناسب. احفظ مواضع هذه المناطق في ملف مرحلة.

استدعاء المواقف المحفوظة وقم بفحص هذه المناطق بشكل أكبر. أضف تكبيرا قدره 3 ، 900 x في وضع البحث عن جرعة منخفضة. حدد المناطق ذات الطبقة الجليدية الرقيقة الموحدة لجمع البيانات ، والتي تتميز باحتوائها على أنابيب طويلة معلقة فوق حفرة.

احفظ جميع المناطق في ملف المرحلة الثانية. قم بالتبديل إلى وضع التعريض الضوئي. أضف تكبيرا قدره 59,000 x وأدخل فتحة موضوعية 100 ميكرومتر.

ثم اضبط وصمة العار الموضوعية وشدة الشعاع لجرعة تقارب 15 إلكترونا لكل أنجستروم مربع لكل تعرض. ارجع إلى وضع البحث عن الجرعة المنخفضة وانتقل إلى وضع محفوظ. تحديد ومركز أنبوب جيد.

باستخدام كاميرا CCD ، قم بالتبديل إلى وضع التركيز البؤري ، اضبط التركيز وقم بتعيين قيمة إلغاء التركيز البؤري بشكل طبيعي بين 0.5 و 2.5 ميكرومتر. ثم قم بالتبديل إلى وضع التعريض الضوئي واضبط وقت التعرض من 0.3 إلى 0.5 ثانية لجرعة 15 إلكترونا لكل أنجستروم مربع. اجمع الصور على كاميرا لوحية ، مما يسمح للأفلام بالاستقرار لمدة 10 ثوان قبل التقاط التعريض الضوئي.

بعد جمع الصور ، انتقل إلى الموضع المحفوظ التالي وكرر هذه العملية لجمع المزيد من الصور. قم بتطوير الأفلام بكامل قوتها D 19 لمدة 12 دقيقة. ثم قم برقمنة الصور باستخدام ماسح ضوئي Nikon Super cool scan 9, 000 ED بحجم بكسل 6.35 ميكرومتر.

يمكن فهرسة الجسم الحلزوني بواسطة معلمتين. ترتيب Bessel N ورقم خط الطبقة L في التحويل الفوري للشبكة السطحية للجسم الحلزوني. يتميز كل خط طبقة ب N و L ويتوافق مع مجموعة من الخطوط على الشبكة السطحية كما يشار إليها بمؤشري H و K.

لبدء الفهرسة الحلزونية ، استخدم برنامج إيمان Helix boxer لإخراج أنبوب طويل ومستقيم نسبيا بقطر موحد وحفظ الصورة بتنسيق MRC. ثم قم بقياس نصف قطر الأنبوب باستخدام برنامج إيمان. حدد مسافة تكرار HEL باستخدام برنامج قائم على الارتباط المتقاطع مثل I-M-G-C-C-F في حزمة MRC.

ثم احسب الردهة. قم بالتحويل بطول صندوق جديد يمثل جزءا لا يتجزأ من مسافة التكرار. بعد ذلك ، اختر خطين أساسيين للطبقة يحددان متجهين شبكيين سطحيين أساسيين ، واحد صفر وصفر واحد بوحدات بكسل FFT.

حدد أرقام خطوط الطبقة بالإضافة إلى أنصاف أقطار الحد الأقصى للسعة لخطي الطبقة الرئيسيين في تحويل فورييه. بالنظر إلى أرقام خطوط الطبقة وقيم أوامر Bessel لخطي الطبقة الرئيسيين ، يمكن الحصول على الدوران بين الوحدات الفرعية والارتفاع المحوري لحلزون النجمة الواحدة باستخدام قاعدة الاختيار كما هو موضح في الإجراء المكتوب. يصف هذان الرقمان الحقيقيان التماثل اللولبي للأنبوب.

تبدأ إعادة البناء ثلاثية الأبعاد بتجزئة الجسيمات باستخدام برنامج إيمان. ملاكم. بعد فتح صورة مجهرية تحتوي على جزيئات حلزونية ، قم بقص الجسيم إلى أجزاء متداخلة في لوحة التحكم الخاصة بالملاكم. اختر وضع اللولب وقم بتعيين معلمات الملاكمة.

يجب أن يكون حجم الصندوق أكبر من قطر الجسيم ويجب أن تكون قيمة OLA حوالي 90٪ من حجم الصندوق. بعد اليسار ، سيؤدي النقر فوق أي من طرفي ملاكم الجسيمات تلقائيا إلى إنشاء سلسلة من صناديق الجسيمات على طول اللولب ، وحفظ الأجزاء المعبأة بالإضافة إلى إحداثياتها. الخطوة التالية هي إجراء إعادة بناء أولية ثلاثية الأبعاد باستخدام طريقة إعادة بناء الفضاء الحقيقي الحلزونية التكرارية I-H-R-S-R قبل المعالجة باستخدام I-H-R-S-R.

اعكس تباين صور cryo-EM وقم بتطبيق تصفية LOWPASS. ثم افتح الواجهة الرسومية لبرنامج I-H-R-S-R عن طريق كتابة المولد. قم بتزويد الواجهة الرسومية بجميع المعلومات الخاصة بمكدس الجسيمات المعبأ، بما في ذلك اسم المكدس ومساره وعدد الصور في المكدس وقيم معلمات التماثل.

انقر فوق الزر "إنهاء" لإنشاء البرنامج النصي لإعادة البناء. ب 25 ل.س. أستخدم أسطوانة صلبة أو مجوفة كمرجع أولي وأسمح للإجراء بالدوران حتى لا تكون هناك تغييرات في التماثل اللولبي المحدد ، والذي يحدث عادة بعد بضع دورات. يجب أن يعطي التماثل الحلزوني الأيمن إعادة بناء متقاربة بثبات.

سيتم استخدام إعادة البناء التي تم إنشاؤها في الدورة الأخيرة كمرجع أولي لمزيد من التحسين. أخيرا ، قم بإجراء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد مع صقل تكراري باستخدام خريطة الكثافة ثلاثية الأبعاد التي تم إنشاؤها بواسطة I-H-R-S-R كمرجع أولي لتحسين إضافي أثناء التحسين. يتم تثبيت التماثل الحلزوني عند الدوران بين الوحدات الفرعية والارتفاع المحوري ، والذي يتم تحديده من إجراء I-H-R-S-R.

بعد ذلك ، حدد إلغاء التركيز والاستجماتيزم الموجودين في الصورة المجهرية باستخدام برامج CTF find three و CTF tilt باستخدام برامج العنكبوت التي تسمى FT و mu تضرب مقاطع الجسيمات بواسطة وظيفة نقل التباين. تقوم CTF المختصرة بمطابقة الإسقاط من خلال مقارنة إسقاطات المجلدات المرجعية بالصور المصححة CTF باستخدام محاذاة متعددة المراجع. يقتصر الاختلاف في زاوية الميل خارج العادية على زائد أو ناقص 10 درجات ويتم أخذ عينات منها في خطوات درجة واحدة تقدم قيودا مثل معاملات الارتباط العالية في الزوايا العادية بالقرب من صفر درجة أو 180 درجة وتحولات X محدودة.

بالنسبة لمعلمات المحاذاة لكل مقطع ، قم بتضمين تلك الأجزاء فقط في إعادة البناء التي تفي بالقيود. بعد كل دورة صقل تكرارية ، يتم إنشاء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد باستخدام الإسقاط الخلفي ومقسومة على بعضها على CTF المربع فرض التماثل الحلزوني لتوليد حجم تماثلات. يتم إنهاء التحسين التكراري عندما لا يحدث أي تحسن إضافي في دقة إعادة البناء ثلاثية الأبعاد الجديدة.

تم وضع مجموعة قفيصة واحدة لفيروس نقص المناعة البشرية ، وهي أنبوب 92 e ، وتم حساب تحويل فورييه لفهرسة نصف قطرها الحلزونية ، وأرقام خط الطبقة ونصف قطر السعة القصوى لخطوط الطبقة واحد صفر وصفر واحد. ثم تم حساب القيم النهائية للسالب 12 و 11 لواحد صفر وصفر واحد على التوالي بمسافة تكرار قدرها 5195.48 أنجستروم. تم تحديد التماثل اللولبي للأنبوب على أنه دلتا Z تساوي 6.81 أنجستروم ودلتا خمسة تساوي 328.88 درجة دلتا Z ودلتا خمسة إلى 7.13 أنجستروم و 328.86 درجة باستخدام I-H-R-S-R وتم إنشاء إعادة بناء أولية بعد 10 دورات تكرارية.

أدت إعادة البناء النهائية بعد التحسين التكراري إلى تحسين خريطة الكثافة بشكل كبير من النموذج الأولي المحسوب باستخدام I-H-R-S-R. يتم عرض خريطة كثافة أنابيب تجميع القفيصة على شكل ثلاث شرائح متعامدة موازية لمحور الأنبوب وقريبة من السطح ، عمودية على محور الأنبوب وموازية لمحور الأنبوب ومن خلاله. ينتج الهيكل المعروض عن عرض السطح لخريطة الكثافة ثلاثية الأبعاد المحددة عند 1.8 سيجما التي تحيط بحجم 100٪.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد جدا لكيفية الحصول على بنية ثلاثية الأبعاد للجزيء المجمع باستخدام المجهر الإلكتروني للغراب.