موسوعة JoVE للتجارب
التقنيات البيولوجية
0 مشاهدة • 2:57 دقيقة • July 8th, 2025
يحتوي الغشاء الخارجي للبكتيريا سالبة الجرام على سموم داخلية تسمى عديدات السكاريد الدهنية ، أو LPS. يحتوي LPS على جزء قليل السكاريد محب للماء ومنطقة دهون كارهة للماء.
بمجرد دخولها إلى المضيف ، تتعرف البروتينات المرتبطة ب LPS على السموم الداخلية. ثم تربط هذه البروتينات المستقبلات على الخلايا المناعية في الدورة الدموية. ينشط هذا الارتباط الخلايا المناعية التي تطلق عوامل التهابية. يؤدي الإفراط في إنتاج هذه العوامل إلى المبالغة في الاستجابة المناعية ، مما يؤدي إلى موت الخلايا.
للكشف عن السموم الداخلية باستخدام Limulus Amoebocyte Lysate ، أو مقايسة LAL ، خذ تركيبة تحتوي على السموم الداخلية المرتبطة بالسطح المحبة للدهون للجسيمات النانوية عبر أجزاء الدهون الكارهة للماء.
أضف كاشف LAL إلى الأنبوب. هذا الكاشف عبارة عن محللة مائية تحتوي على إنزيمات وبروتينات غير نشطة مشتقة من الخلايا الأميبية - خلايا دم سلطعون حدوة الحصان.
احتضان الأنبوب لتسهيل ارتباط السموم الداخلية بعامل التخثر غير النشط المشتق من المحللة ، وتنشيط ذلك ذاتيا.
يشق العامل المنشط C إنزيما آخر ، العامل B ، مكونا بروتياز يشق إنزيما مؤيدا للتخثر ويحوله إلى شكل نشط - إنزيم تخثر الليمولوس. يشق هذا الإنزيم التخثر - بروتين تخثر غير نشط - في الغوثرة.
ترتبط مونومرات الكواغلين عبر ذيولها الكارهة للماء بالرؤوس الكارهة للماء لمونومرات الكواغلين الأخرى. ينتج عن هذه البلمرة الذاتية تكوين بوليمر متجانس يظهر على شكل جلطة هلامية في قاعدة الأنبوب. اقلب الأنبوب برفق.
تؤكدالجلطة الصلبة التي تبقى في قاع الأنبوب وجود السموم الداخلية.
لإجراء جلطة هلامية LAL ، قم بإعداد السموم الداخلية القياسية للتحكم إلى التركيز النهائي ل 4 لامدا ، وامزج 100 ميكرولتر من المعيار مع 100 ميكرولتر من الماء ، أو عينة الاختبار ، لتحقيق التركيز النهائي للسموم الداخلية القياسية للتحكم 2 لامدا.
أضف 100 ميكرولتر من المحللة إلى كل تخفيف لامدا. دوامة الأنابيب لفترة وجيزة ، ووضع رف الأنابيب في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
في نهاية الحضانة ، اقلب الأنابيب بحركة سلسة ، وسجل النتائج يدويا باستخدام علامة الجمع لجلطة ثابتة ، وناقص لعدم وجود جلطة أو جلطة فضفاضة.