العمل الشعري الشعاعي التفاضلي لمقايسة الترابط: تقنية عالية الإنتاجية لتحديد البروتينات داخل الخلايا المرتبطة بالرسول الثاني للنيوكليوتيدات البكتيرية

تنتج البكتيريا رسل ثان للنوكليوتيدات ، NSMs - جزيئات الإشارات داخل الخلايا - استجابة للمنبهات المناسبة. ترتبط هذه الجزيئات بالبروتينات المستهدفة وتنظم الوظائف البكتيرية.

لتحديد هذه البروتينات المستهدفة باستخدام العمل الشعري الشعاعي التفاضلي لمقايسة الترابط ، خذ صفيحة متعددة الآبار تحتوي على محللة الخلايا البكتيرية التي تحتوي على بروتينات قابلة للذوبان. يتم اشتقاق هذه البروتينات من استنساخ بكتيري مختلف يعبر عن ORFs الفردية - إطارات قراءة مفتوحة - في الجينوم ، مما يضمن أن كل بئر يحتوي على بروتين مميز.

أضف مزيجا من فوسفات الجوانوزين رباعي الخماسي - NSMs المسمى بالفوسفور المشع. ترتبط هذه الجزيئات بالبروتينات المستهدفة في المحللة. باستخدام أداة الدبوس ، اجمع كمية متساوية من السائل من كل بئر. ضع الأداة على غشاء النيتروسليلوز لترسيب السائل على شكل بقع.

ترتبط البروتينات المستهدفة بالغشاء من خلال التفاعلات غير التساهمية التي تمنع انتشارها. هذا يعزل NSMs ذات العلامات الراديوية المقيدة في النقطة المركزية للتطبيق. تنتشر NSMs الحرة شعاعيا مع الطور السائل عن طريق العمل الشعري.

استخدم التصوير الفوسفوري للكشف عن الإشارات المشعة والحصول على صورة رقمية للبقع. حدد البقع باستخدام دائرتين. يصور الجزء الخارجي محيط NSMs المنتشرة. تمثل الدائرة الداخلية NSMs المعزولة.

احسب جزء الربط - شدة النشاط الإشعاعي المكتشف من الدائرة الداخلية على إجمالي النشاط الإشعاعي للبقعة المنتشرة. حدد البقع ذات الكسور عالية الارتباط لتحديد الآبار ذات البروتينات المستهدفة المرتبطة ب NSM.

لفحص DRaCALA للبروتينات المستهدفة ، أضف 20 ميكرولترا من محللات الخلية الكاملة المذابة إلى الآبار الفردية لصفيحة ميكروتيتر القاع 96 بئرا على شكل حرف V ، وأضف 2.5 وحدة من نوكلياز داخلي Serratia marcescens إلى كل بئر. بعد 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، ضع المحللات على الثلج لمدة 20 دقيقة.

بعد ذلك ، امزج كميات متساوية من الفوسفور الخماسي الفوسفاتي 32 ورباعي فوسفات الجوانوزين ، وأضف 1x محلول التحلل # 1 إلى الخليط للحصول على محلول خماسي فوسفات جوانوزين رباعي نانو مولار.

باستخدام ماصة متعددة القنوات وأطراف ماصة مفلترة، امزج 10 ميكرولترات من خليط خماسي فوسفات الجوانوزين مع محللة الخلية لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

في نهاية الحضانة ، اغسل أداة دبوس 96X ثلاث مرات في محلول 0.01٪ من المنظفات غير الأيونية لمدة 30 ثانية ، متبوعا ب 30 ثانية من التجفيف على منشفة ورقية لكل غسلة ، قبل وضع أداة الدبوس في لوحة العينة المكونة من 96 بئر. بعد 30 ثانية ، ارفع أداة الدبوس بشكل مستقيم وضعها لأسفل مباشرة على غشاء النيتروسليلوز لمدة 30 ثانية.

بعد خمس دقائق من التجفيف ، ضع غشاء النيتروسليلوز في المجلد البلاستيكي الشفاف لتخزين التعرض لشاشة الفوسفور وتصورها عن طريق التصوير الفوسفوري ، كما هو موضح.

لتحديد وتحديد البروتينات المستهدفة المحتملة في برنامج التحليل المرتبط بتصوير الفوسفور ، افتح ملف .gel الخاص باللوحات المرئية.

لتحديد النقاط المراد تحليلها ، استخدم وظيفة "تحليل المصفوفة" لإعداد شبكة من 12 عمودا في 8 صفوف. لتقييد الحافة الخارجية للبقع بأكملها ، حدد الدوائر الكبيرة. قم بتصدير "Volumn + Background" و "Area" للدوائر الكبيرة المحددة إلى جدول بيانات ، لتقييد النقاط الداخلية الصغيرة. قم بتقليل حجم الدوائر المحددة.

قم بتصدير "Volumn + Background" و "Area" للدوائر الصغيرة المحددة واحفظ جميع البيانات في جدول البيانات. ضع الدوائر لتتداخل مع البقع حسب الضرورة ، وتغيير حجمها إلى أكبر قليلا من البقع الفعلية.

استخدم المعادلة لحساب كسور الربط في جدول البيانات، ورسم البيانات. بعد ذلك ، حدد بروتينات الربط المحتملة في الآبار التي تظهر كسورا عالية الارتباط مقارنة بغالبية الآبار الأخرى.