العمل الشعري الشعاعي التفاضلي لمقايسة الترابط: تقنية عالية الإنتاجية لتحديد البروتينات داخل الخلايا المرتبطة بالرسول الثاني للنيوكليوتيدات البكتيرية

تنتج البكتيريا رسل ثان للنوكليوتيدات ، NSMs - جزيئات الإشارات داخل الخلايا - استجابة للمنبهات المناسبة. ترتبط هذه الجزيئات بالبروتينات المستهدفة وتنظم الوظائف البكتيرية.

لتحديد هذه البروتينات المستهدفة باستخدام العمل الشعري الشعاعي التفاضلي لمقايسة الترابط ، خذ صفيحة متعددة الآبار تحتوي على محللة الخلايا البكتيرية التي تحتوي على بروتينات قابلة للذوبان. يتم اشتقاق هذه البروتينات من استنساخ بكتيري مختلف يعبر عن ORFs الفردية - إطارات قراءة مفتوحة - في الجينوم ، مما يضمن أن كل بئر يحتوي على بروتين مميز.

أضف مزيجا من فوسفات الجوانوزين رباعي الخماسي - NSMs المسمى بالفوسفور المشع. ترتبط هذه الجزيئات بالبروتينات المستهدفة في المحللة. باستخدام أداة الدبوس ، اجمع كمية متساوية من السائل من كل بئر. ضع الأداة على غشاء النيتروسليلوز لترسيب السائل على شكل بقع.

ترتبط البروتينات المستهدفة بالغشاء من خلال التفاعلات غير التساهمية التي تمنع انتشارها. هذا يعزل NSMs ذات العلامات الراديوية المقيدة في النقطة المركزية للتطبيق. تنتشر NSMs الحرة شعاعيا مع الطور السائل عن طريق العمل الشعري.

استخدم التصوير الفوسفوري للكشف عن الإشارات المشعة والحصول على صورة رقمية للبقع. حدد البقع باستخدام دائرتين. يصور الجزء الخارجي محيط NSMs المنتشرة. تمثل الدائرة الداخلية NSMs المعزولة.

احسب جزء الربط - شدة النشاط الإشعاعي ا