فحص امتصاص الكالسيوم في الميتوكوندريا: طريقة قائمة على قارئ الألواح لقياس امتصاص الكالسيوم في الميتوكوندريا المعزولة

تمتص الميتوكوندريا الكالسيوم العصاري الخلوي لأنه ضروري لأدائها بشكل صحيح.

التدفق المفرط للكالسيوم إلى مصفوفة الميتوكوندريا - الحمل الزائد للكالسيوم في الميتوكوندريا - إلى فتح قناة غشاء داخلية ، أو مسام انتقال نفاذية الميتوكوندريا ، أو MPTP. تسمح المسام المفتوحة بزيادة تدفق الكالسيوم من الميتوكوندريا ، مما يتسبب في خلل في الميتوكوندريا.

لقياس امتصاص الكالسيوم في الميتوكوندريا ، ابدأ بصفيحة متعددة الآبار تحتوي على ميتوكوندريا معزولة معلقة في مخزن مؤقت مناسب. استكمل البئر بالبيروفات والمالات ، وهما ركائز منتجة ل ATP. اخلطي محتويات البئر واحتضنها.

أثناء الحضانة ، يتم تحويل البيروفات والمالات إلى ATPs ، مما ينشط الميتوكوندريا. أضف محلولا يحتوي على جزيئات صبغة فلورية غير منفذة لغشاء الميتوكوندريا وحساسة للكالسيوم. قم بتوزيع المخزن المؤقت المحتوي على الكالسيوم إلى الميتوكوندريا المنشطة.

راقب مضان الكالسيوم في الصبغة حيث ترتبط جزيئات الصبغة بالكالسيوم الحر في المخزن المؤقت.

أضف المزيد من أيونات الكالسيوم لبدء تدفق الكالسيوم في الميتوكوندريا. يقلل كالسيوم الميتوكوندريا المتزايد تدريجيا من أيونات الكالسيوم في المخزن المؤقت ، مما يقلل من مضان الكالسيوم في الصبغة.

بمجرد أن تصل الميتوكوندريا إلى أقصى قدرة لها على حمل الكالسيوم ، فإن الإضافة الإضافية لأيونات الكالسيوم تفتح قنوات MPTP وتستورد الكالسيوم إلى المخزن المؤقت. يرتبط الكالسيوم العازل بجزيئات الصبغة ، مما يتسبب في زيادة مضان الكالسيوم في الصبغة.

ارسم مضان الصبغة في نقاط زمنية مختلفة من إضافة الكالسيوم لمراقبة حركية امتصاص الكالسيوم في الميتوكوندريا.

لبدء قياس امتصاص الكالسيوم في الميتوكوندريا باستخدام قارئ الألواح ، قم ببرمجة القارئ لإجراء قراءة حركية لمضان الكالسيوم الأخضر 5N كل ثانية ، لمدة إجمالية تبلغ 1,000 ثانية.

قم ببرمجة حاقنات الكاشف لتوزيع 5 ميكرولتر من محلول كلوريد الكالسيوم في نقاط زمنية مختلفة. بعد ذلك ، قم بتجهيز الحاقنات بمحلول كلوريد الكالسيوم الذي سيتم استخدامه.

بعد ذلك ، أضف 200 ميكروغرام من الميتوكوندريا المعزولة إلى بئر واحد من صفيحة 96 بئرا ، وأضف الحجم المناسب من عازلة كلوريد البوتاسيوم لتحقيق حجم إجمالي يبلغ 197 ميكرولترا. ثم أضف 1 ميكرولتر من 1 بيروفات مولار، و1 ميكرولتر من 500 مللي مولار من المالات، و1 ميكرولتر من 1 مللي مولار من مخزون الكالسيوم الأخضر -5N ، واخلطهم برفق عن طريق سحب العينات.

احتضان محمي من الضوء في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين ، حتى تصبح الميتوكوندريا نشطة. أخيرا ، ابدأ البروتوكول الحركي المبرمج مسبقا ، وراقب تألق الكالسيوم الأخضر 5N.