لماذا يُستخدم مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) للتحقق من اقتران الجسم المضاد بالمستضد؟

يؤكد اختبار ELISA نجاح عملية الاقتران من خلال الكشف عن تكوين معقدات (جسم مضاد-مستضد-جسم مضاد) عبر تفاعل لوني. ويوفر ذلك قراءة كمية ونوعية تميز بين الأنواع المقترنة وغير المقترنة. كما تدعم هذه الطريقة قرارات المتابعة أو الإيقاف في تطوير المقترنات من خلال التحقق من إمكانية الوصول إلى الحاتمة بعد عملية الربط.

كيف يحسن محلول الحجب من دقة اختبار ELISA في التحقق من عملية الاقتران؟

يمنع الحجب الارتباط غير النوعي لمركبات الجسم المضاد والمستضد بسطح لوحة ELISA، مما يقلل من إشارة الخلفية. وهذا يضمن أن الإشارة المكتشفة تعكس فقط الارتباط النوعي بين الجسم المضاد المُلتقط وحاتمة المستضد. وتؤدي زيادة النوعية إلى تعزيز الثقة في تقدير كفاءة الاقتران كمياً.

ما الذي يقيسه التحليل الطيفي الضوئي في بروتوكول ELISA هذا؟

يقيس القياس الطيفي للامتصاص درجة امتصاص المنتج الملون الناتج عن تفاعل الإنزيم مع الركيزة، وهو ما يرتبط بكمية الأجسام المضادة المرتبطة بالإنزيم. يوفر هذا قراءة كمية تتناسب طردياً مع تركيز مُعقدات الجسم المضاد والمستضد في كل بئر. وتتيح هذه البيانات إجراء مقارنة عبر سلسلة التخفيفات لتقييم كفاءة الاقتران.

لماذا يُستخدم التخفيف التسلسلي لمركبات الأجسام المضادة والمستضدات في عملية التحقق من مقايسة ELISA؟

يؤدي التخفيف التسلسلي إلى إنشاء منحنى قياسي لتقدير كفاءة الاقتران عبر نطاق من التركيزات، من العالية إلى المنخفضة. وهذا يتيح للباحثين تحديد حد الكشف وتقييم حساسية المقايسة. كما يدعم تسلسل التخفيف استكمال قيم التركيزات المجهولة للعينات ويضمن وقوع النتائج ضمن النطاق الديناميكي للمقايسة.

ما هو الجسم المضاد المرتبط بإنزيم محدد والمستخدم للكشف في مقايسة ELISA هذه؟

يُستخدم الجسم المضاد المقترن بإنزيم بيروكسيداز الفجل الحار ضد مقترن anti-DEC-205/OVA للكشف عن الجسم المضاد الأولي الموجود في معقد المستضد والجسم المضاد. يرتبط هذا الجسم المضاد المرتبط بالإنزيم بشكل محدد بمنطقة Fc أو النمط الفردي (idiotype) للجسم المضاد المُلتقط في المقترن. بعد ذلك، يحفز إنزيم بيروكسيداز الفجل الحار تفاعلاً لونياً يتيح الكشف باستخدام القياس الطيفي الضوئي.

مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم للتحقق من اقتران الأجسام المضادة ومستضد المقترنة كيميائيا

JoVE Encyclopedia of Experiments

التقنيات البيولوجية

0 مشاهدات • 2:57 د • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لاستنساخ استجابة مناعية ، ترتبط المستضدات بالأجسام المضادة الخاصة بالمستقبلات الداخلية الموجودة على سطح الخلايا المتغصنة ، أو DCs - الخلايا العارضة للمستضد - والتي تساعد في امتصاص المستضدات.

يعد تكوين مركب مستضد الأجسام المضادة خطوة حاسمة ويمكن تحقيقه في المختبر عن طريق اقتران المستضد كيميائيا بجسم مضاد أحادي النسيلة يستهدف التيار المستمر.

للتحقق من كفاءة عملية الاقتران ، ابدأ بلوحة ELISA المغلفة مسبقا بالأجسام المضادة التي تم التقاطها. عالج اللوحة بمحلول مانع لمنع الارتباط غير المحدد للمستضدات بالسطح المطلي.

أضف متقارنات كيميائيا متشابكة كيميائيا ، ومستضد الأجسام المضادة إلى اللوحة ، واحتضنها. تتفاعل الحاتمة المحددة للمستضد مع نظيرة الجسم المضاد الملتقط مكونا مركبا للجسم المضاد والمستضد والأجسام المضادة.

بعد ذلك ، قم بتراكب اللوحة بمجموعة ثالثة من الأجسام المضادة المرتبطة بالإنزيم. ترتبط هذه الأجسام المضادة على وجه التحديد بالأجسام المضادة الأولية الموجودة في المترافق ، مما يتيح اكتشافها.

أضف عازلة تحتوي على الركيزة الملونة لتصور المترافقات. يتفاعل الإنزيم المرتبط بالجسم المضاد مع الركيزة ، مما يولد المنتج الملون.

عالج اللوحة بمحلول تعطيل محمض ، مما يعطل الإنزيم وينهي التفاعل. تحليل اللوحة القياس الطيفي. يتحقق وجود محلول ملون من وجود اقتران الأجسام المضادة والمستضد ويؤكد الاقتران الناجح.

للتحقق من نجاح الاقتران بواسطة ELISA ، قم بتغطية لوحة ELISA مناسبة مكونة من 96 بئرا ب 100 ميكرولتر من الجسم المضاد ل OVA لكل بئر ، وقم بتخفيف مضاد DEC-205 / OVA بشكل متسلسل بنسبة 1: 2 في المخزن المؤقت للحجب ، للحصول على تخفيفات من 6 ميكروغرام لكل مليلتر إلى 93.8 نانوجرام لكل مليلتر.

أضف 100 ميكرولتر من كل تخفيف إلى الآبار المناسبة للوحة المغلفة بالأجسام المضادة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة ، أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد المترافق مع بيروكسيداز الفجل الحار ضد المقترن المضاد ل DEC-205 / OVA إلى اللوحة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولترا من ركيزة بيروكسيداز الفجل الحار إلى كل بئر ، للسماح بتحليل تفاعل اللون عن طريق قياس الطيف الضوئي.