لماذا تهم الاعتمادية على إنزيم لاكتات ديهيدروجيناز في عملية التحقق من الهدف؟

يعتمد المقاييس على إنزيم lactate dehydrogenase خارجي المنشأ لتحويل lactate إلى pyruvate، مما يضمن عدم تداخل توليد الإشارة مع الإنزيمات الداخلية الموجودة في المستخلص الخلوي. ويسمح هذا الاعتماد بنسب الإشارة اللونية بدقة إلى تركيز lactate، مما يدعم التحقق الدقيق من الهدف في المسارات الأيضية.

كيف يتناسب عزل اللاكتات كمتغير مستقل مع مسار عملية الاكتشاف؟

من خلال قياس مستويات اللاكتات كدالة للظروف التجريبية، يعزل هذا المقايسة اللاكتات كمخرج قابل للقياس لتدفق تحلل السكر، مما يمكن الباحثين من ربط الاضطرابات الجينية أو الدوائية بالتغيرات في عملية التمثيل الغذائي للطاقة. ويدعم ذلك الاكتشاف المبكر من خلال توفير مؤشر حيوي كمي ومنخفض المخاطر لنشاط المسار.

ما الذي تتيحه قياسات الامتصاصية الكمية عند 570 nm؟

تُستخدم قراءات الامتصاصية عند 570 nm، بعد طرح الخلفية، لإنشاء منحنى قياسي من تركيزات اللاكتات المعروفة، مما يسمح باستقراء مستويات اللاكتات في العينات المختبرة. وتتيح هذه النتيجة الكمية إجراء تحليل الاستجابة للجرعة والمقارنة بين المجموعات التجريبية في حملات الفحص.

لماذا تهم متطلبات التحليل المكرر في التعاون متعدد الوظائف؟

يؤدي إجراء قياسات مكررة لكل عينة إلى زيادة موثوقية البيانات وتقليل التباين التقني، وهو أمر ضروري لضمان اتساق التفسيرات بين فرق البيولوجيا والفحص والتحليلات. وتدعم هذه الممارسة عمليات التسليم القابلة للتكرار بين وحدات الاكتشاف والوحدات قبل السريرية.

ما هي إمكانيات التحليل الإحصائي المطلوبة قبل التنفيذ؟

يجب أن تكون الفرق قادرة على إنشاء منحنى معايرة، وإجراء تحليل انحدار خطي، واستنتاج التراكيز المجهولة من المنحنى، يليه تصحيح عامل التخفيف (على سبيل المثال، الضرب في 2.25 كما هو مذكور في البروتوكول). تضمن هذه القدرات التحديد الكمي الدقيق للاكتات من بيانات الامتصاص الخام.

الفحص اللوني للقياس الكمي للاكتات في عينات الاختبار

JoVE Encyclopedia of Experiments

التقنيات البيولوجية

0 مشاهدات • 3:08 د • July 8th, 2025

في الخلايا الحية، في ظل الظروف اللاهوائية، يحول إنزيم نازعة هيدروجين اللاكتات البيروفات - وهو منتج نهائي لتحلل السكر - إلى لاكتات - مستقلب رئيسي. تعكس كمية اللاكتات المنتجة في الخلايا حالة التمثيل الغذائي لها.

لتحديد تركيز اللاكتات داخل الخلايا ، ابدأ بعينة اختبار من محللة الخلايا الخيطية الخالية من البروتين. استكمل الآبار الأخرى لصفيحة متعددة الآبار بمحلول لاكتات بتركيزات مختلفة معروفة.

يفتقر المحللة إلى جميع الإنزيمات البروتينية ، بما في ذلك نازعة هيدروجين اللاكتات الذاتية ، مما يضمن القياس الكمي الدقيق لللاكتات.

أضف مخزن مخزن لاکتات في كل بئر للحفاظ على درجة الحموضة المناسبة للنشاط الأنزيمي الأمثل. استكمل الآبار بمزيج تفاعلي يحتوي على إنزيم نازعة هيدروجين اللاكتات ، ونيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد - NAD - وهو إنزيم مساعد ، ومسبار قياس الألوان واحتضانه.

أثناء الحضانة ، يحفز نازعة هيدروجين اللاكتات أكسدة اللاكتات الخلوية إلى البيروفات ، مع تقليل NAD في وقت واحد إلى NADH. يتفاعل NADH المتولد مع المسبار اللوني لإنتاج منتج أرجواني.

قياس امتصاص المحلول الأرجواني طيفيا لعينة الاختبار ومعايير اللاكتات عند 570 نانومتر. ارسم قيم الامتصاص لمعايير اللاكتات وقم بإنشاء منحنى المعايرة.

أخيرا ، قارن قيمة امتصاص العينة بمعايير اللاكتات لتحديد كمية اللاكتات الموجودة في عينة الاختبار.

لقياس تركيز اللاكتات ، استخدم مجموعة مقايسة القياس اللوني لإجراء تحليل مكرر لعينات الاختبار. أضف 10 ميكرولترات من عينات الاختبار إلى كل بئر من صفيحة 96 بئرا ، ثم أضف مخزن فحص اللاكتات إلى كل عينة لضبط الحجم إلى 50 ميكرولترا.

تمييع معيار 100 ملليمولار لتر (+) -لاكتات مع مخزن مقايسة اللاكتات إلى 1 ملليمول. ثم ، في سلسلة من الآبار ، أضف 0 و 2 و 4 و 6 و 8 و 10 ميكرولتر من معيار L (+) -Lactate المخفف. أضف 50 ميكرولترا من مزيج التفاعل في كل بئر ، واحتضنه في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء لمدة 30 دقيقة على الأقل حتى يتطور اللون.

أخيرا ، استخدم قارئ الصفيحة الدقيقة لقياس امتصاص كل بئر عند 570 نانومتر. اطرح امتصاص مزيج التحكم في الخلفية من امتصاص مزيج التفاعل. بعد ذلك ، ارسم منحنى اللاكتات القياسي ، واحسب تركيزات اللاكتات من المنحنى بضرب كل تركيز في 2.25.